تعیین تنوع ژنتیکی ارقام گلابی با استفاده از نشانگرهای ISSR

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

چکیده

ایران با نزدیکی به مراکز تنوع گلابی و نیز دارا بودن بیش از ده گونه از جنس Pyrus به عنوان یکی از مهم‌ترین منابع ژنتیکی گلابی در دنیا شناخته‌شده است. از طرف دیگر، کشور ایران با 17000 هکتار سطح  زیر کشت، یکی از مراکز تولید گلابی محسوب می شود. با وجود موقعیت ممتاز جغرافیایی، هنوز اطلاعات دقیقی از روابط بین ژنوتیپ‌های مختلف گلابی در ایران وجود ندارد و مشخص نیست چه نسبت ژنتیکی بین  ارقام بومی ایرانی با ارقام تجارتی وارداتی وجود دارد. در این تحقیق به منظور گروه‌بندی 10 ژنوتیپ گلابی ایرانی و تعیین موقعیت ژنتیکی آن ها در بین13 رقم وارداتی، از تکنیک مبتنی بر ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) استفاده شد. پانزده آغازگر ISSR به کار رفته، در مجموع 257 باند تکثیر نمود که 213 باند دارای چندشکلی (سطح چندشکلی 6/81 درصد) بود. دندروگرام ژنوتیپ های گلابی مورد استفاده در این تحقیق با الگوهای باندی ISSR با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA با نرم افزار NTSYS V. Pc-2.02e، ‌رسم شد. گلابی های مورد بررسی در سه دسته مجزا قرار گرفتند. در گروه اول کنفرنس، محمدعلی، سردرودی، بارتلت، ردبارتلت، هراسویت، پاس‌کراسان، دوین دوکومیس، آنجو، فلسطینی، لوئیس‌بن، دوشس و دره‌گزی، در گروه دوم کولی خوج، خوج لب ترش، خوج کته سر، دم کج، سبری، خوج مرداب انزلی و شاه‌میوه و در گروه سومSK10 و SK13 قرار گرفتند. ارقام براساس خاستگاه جغرافیایی طبقه بندی گردید و ارقام متعلق به P. communis و P. pyrifolia کاملاً از هم جدا شدند. ارقام ایرانی تجارتی دم کج، شاه میوه و سبری همراه با خوج‌ها در یک دسته قرار گرفتند که به نظر می‌رسد از خوج‌ها منشأ گرفته باشند در حالی که سه رقم محمدعلی، دره گزی و سردرودی نزدیکی بیشتری به ارقام اروپایی نشان دادند و احتمالاً منشأ متفاوتی از خوج ها داشته و با ارقام اروپایی اجداد مشترکی دارند. نتایج این بررسی کارامد بودن نشانگر ISSR برای انگشت‌نگاری ارقام گلابی را اثبات می نماید.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Determination of genetic diversity in pear genotypes using ISSR markers

نویسندگان [English]

  • Maryam Safar Pour
  • Rouhollah Hosseini Monfared
  • Solmaz Paydar
  • Mastaneh Sharifi
چکیده [English]

Iran is known as one of the most important pear genetic resources because of being near to the pear diversity centers and having more than 10 species of genus Pyrus. On the other hand, Iran with acreage of 17,000 hectares, is one of the pear production centers .Despite its unique geographical location, there is no sufficient genetic information among pear germplasm in Iran and it is not clear what genetic relationship is between Iranian local genotypes and imported genotypes. In this study, Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers was used for clustering  of 10 Iranian Pear genotypes and positioning  of their genetic variation among 13 imported genotypes. Fifteen ISSR primers were screened that yielded a total of 257 amplified products, of which 213 bands (81.6%) were polymorphic. Dendrogram of pear cultivars with ISSR banding patterns was drawn with NTSYS V. Pc-2.02e software using Dice coefficient and UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Average), method .The 23 genotypes of pear were clustered in to three groups. The first group includes Conference, Mohammad Ali, Sardroudi, Bartlett, Red Bartlett, Harrow Sweet, Pass Crassane, Doyenneducomice, Anjou, Palestine,Lies Bonne, Duchesse and Daregazi. Kolikhaj, Sebri, Khuj labtorsh, Dom kaj, Khuj Katesar, Khuj Mordab Anzali and Shah Miveh belong to the second group. The third group includes SK10 and SK13. Cultivars were classified according to the geographical origin and the figures belonging to P. communis and P. pyrifolia, were completely separated. Iranian commercial cultivars including: Dom kaj, Shah miveh, Sebri with different Khuj accessions were placed in a group, that seems that thay have originated from different Khuj. While the three cultivars: Mohammad Ali, Sard roudi and Daregazi revealed closer to the European figures and possibility they have different origin than different Khuj And have a common ancestor with European figures. The results of this study indicate that ISSR markers have higher level of discrimination in evaluating genetic diversity and fingerprinting of pear genotypes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • genetic diversity
  • ISSR markers
  • pear

تعیین تنوع ژنتیکی ارقام گلابی با استفاده از نشانگرهای ISSR

مریم صفرپور شورباخلو1، روح اله حسینی منفرد2 سولماز پایدار1، مستانه شریفی*[1]

1 کارشناس مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی فارس

2 دانشجوی کارشناس ارشد دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارسنجان

تاریخ دریافت: 03/12/1392، تاریخ پذیرش: 16/04/1393

 

چکیده

ایران با نزدیکی به مراکز تنوع گلابی و نیز دارا بودن بیش از ده گونه از جنس Pyrus به عنوان یکی از مهم‌ترین منابع ژنتیکی گلابی در دنیا شناخته‌شده است. از طرف دیگر، کشور ایران با 17000 هکتار سطح  زیر کشت، یکی از مراکز تولید گلابی محسوب می شود. با وجود موقعیت ممتاز جغرافیایی، هنوز اطلاعات دقیقی از روابط بین ژنوتیپ‌های مختلف گلابی در ایران وجود ندارد و مشخص نیست چه نسبت ژنتیکی بین  ارقام بومی ایرانی با ارقام تجارتی وارداتی وجود دارد. در این تحقیق به منظور گروه‌بندی 10 ژنوتیپ گلابی ایرانی و تعیین موقعیت ژنتیکی آن ها در بین13 رقم وارداتی، از تکنیک مبتنی بر ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) استفاده شد. پانزده آغازگر ISSR به کار رفته، در مجموع 257 باند تکثیر نمود که 213 باند دارای چندشکلی (سطح چندشکلی 6/81 درصد) بود. دندروگرام ژنوتیپ های گلابی مورد استفاده در این تحقیق با الگوهای باندی ISSR با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA با نرم افزار NTSYS V. Pc-2.02e، ‌رسم شد. گلابی های مورد بررسی در سه دسته مجزا قرار گرفتند. در گروه اول کنفرنس، محمدعلی، سردرودی، بارتلت، ردبارتلت، هراسویت، پاس‌کراسان، دوین دوکومیس، آنجو، فلسطینی، لوئیس‌بن، دوشس و دره‌گزی، در گروه دوم کولی خوج، خوج لب ترش، خوج کته سر، دم کج، سبری، خوج مرداب انزلی و شاه‌میوه و در گروه سومSK10 و SK13 قرار گرفتند. ارقام براساس خاستگاه جغرافیایی طبقه بندی گردید و ارقام متعلق به P. communis و P. pyrifolia کاملاً از هم جدا شدند. ارقام ایرانی تجارتی دم کج، شاه میوه و سبری همراه با خوج‌ها در یک دسته قرار گرفتند که به نظر می‌رسد از خوج‌ها منشأ گرفته باشند در حالی که سه رقم محمدعلی، دره گزی و سردرودی نزدیکی بیشتری به ارقام اروپایی نشان دادند و احتمالاً منشأ متفاوتی از خوج ها داشته و با ارقام اروپایی اجداد مشترکی دارند. نتایج این بررسی کارامد بودن نشانگر ISSR برای انگشت‌نگاری ارقام گلابی را اثبات می نماید.

کلمات کلیدی: گلابی، تنوع ژنتیکی،  نشانگر ISSR.

 


مقدمه

در دهه های اخیر تنوع زیستی، به عنوان ماده خام و دستمایه اصلی اصلاح گران برای تولید فرآورده های زیستی، توجه پژوهشگران زیادی را به خود جلب کرده است. بنابراین، به موازات گسترش فنون روش های زیست فن آوری به عنوان سرمایه و ثروتی که روز به روز ارزش بیشتری می یابد، باید در رأس اولویت های تحقیقات قرار گیرد (Vejdani,1997).

درخت گلابی که از دوران قبل از تاریخ به سبب حضور طبیعی در فلات ایران مورد توجه مردم این سرزمین قرار گرفته است، از جنس Pyrus، عضوی از زیرخانواده Pomoideae و خانواده Rosaceae است. در این جنس 22 گونه اولیه بومی اروپا، آسیا و مناطق کوهستانی شمال آفریقا، شش هیبرید بین گونه ای طبیعی و حداقل سه هیبرید مصنوعی قرار دارند (Bell, 1990). تقریباً همه گونه‌های Pyrus دیپلوییدهایی با 17 جفت کروموزوم (342n=) هستند و به دلیل آن که به طور گامتوفیتی خودناسازگار[2] می باشند، تنوع بالایی در این جنس وجود دارد
 (Bell & Hought, 1986).

ارقام گلابی را به دو تیپ شرقی[3] (شرق دور) و اروپایی تقسیم می کنند. ارقام شرقی که با نام گلابی آسیایی یا با اسم ژاپنی nashi شناخته شده­اند، در چین و ژاپن کشت می­گردند و در بیرون از آسیا به ندرت دیده می­شوند. مشخصه عمده آنها بافت ترد و مزه شیرین است و مانند سیب روی شاخه می رسند. گونه مهم اقتصادی این دسته P. pyrifolia می­باشد (Bell, 1990). تیپ دوم گلابی‌های اروپایی هستند. ترکیب بافت کره مانند با مزه و عطر خوشایند از خصوصیات این دسته می‌باشد. گونه مهم اقتصادی این گروه P. communis می­باشد که تقریباً %90 واریته های گلابی کشت شده در دنیا را شامل می‌شود
(Atar, 2001)

کمبود جمعیت های وحشی اجدادی به خصوص در گونه های بسیار کشت شده امروزی، محدود بودن تنوع مورفولوژیکی بین ارقام و گونه‌ها، نبود خصوصیات متمایز کننده بین گونه ها و نیز تلاقی وسیع بین گونه ای[4] که سبب بوجود آمدن ارقام و حتی گونه های وحشی با خصوصیات بینابینی شده است، عواملی هستند که دسته بندی گلابی ها را مشکل ساخته‌اند
 (Iketani et al., 1998). گرچه خصوصیات مورفولوژیکی و تجزیه تحلیل‌های آیزوزایمی دو روش مهم برای بررسی تنوع ژنتیکی داخل جنس Pyrus بوده است، ولی به دلیل محدودیت نشانگرهای مورفولوژیکی و آیزوزایمی، اعتبار دسته بندی ارقام گلابی با چنین روش‌هایی مورد تردید می­باشد. به همین جهت در سال‌های اخیر استفاده از روش‌های ملکولی برای تعیین مشخصات ژنتیکی گونه و ارقام گلابی توجه بیشتری را جلب کرده است
 (Yamamoto et al., 2001 a,b; Wünsch & Hormaza, 2007) در ارزیابی تنوع ژنتیکی گلابی به طور وسیعی نشانگرهای RAPD (JianXin et al., 2004; Sharifani & Jackson, 2000; Ye et al, 1996 ;Wang & Dolatowski et al 2004.)، AFLP (Monta–Corvo et al., 2000)، SSR (Inoue et al., 2007; Ghosh et al., 2006; Fernández-Fernandez et al., 2006; Bassil, et al,. 2005 & 2004) و ISSR (Monte-Corro et al., 2002 &2001) مورد استفاده قرار گرفته­اند. در میان این نشانگرها، استفاده از نشانگر ISSR به چندین دلیل توصیه می­شود. تکنیک ISSR برخلاف SSR، به اطلاعات قبلی از توالی DNA نیاز ندارد و آغازگرهای طراحی شده دارای حقوق انحصاری نیستند. به همین دلیل هزینه اولیه برای تعیین توالی آغازگرهای ISSR پایین است (Chenneaui-Kourda et al., 2007). کار با ISSR آسان و سریع می باشد و چندشکلی بالایی نشان می­دهد (Wünsch & Hormaza 2002). محصولات تکثیر شده معمولاً 200 تا 2000 جفت باز طول دارند و با دو روش الکتروفورز آگاروز و اکریل‌آمید قابل بررسی هستند و نیاز به استفاده از مواد رادیواکتیو ندارد
((Branchard & Bornat, 2001. به سبب استفاده از آغازگرهای بلند (16 تا 25 مری) در مقایسه با آغازگرهای RAPD (10 مری)، تکرارپذیری ISSR بسیار بالا است (Wünsch & Hormaza, 2007).

برتری ISSR  نسبت به برخی تکنیک­های مولکولی دیگر در دامنه وسیعی از گونه­های گیاهی مانند برنج، گندم و سیب زمینی شیرین[5] گزارش شده است et al., 2002) .(Reddy در بررسی تنوع ژرم پلاسم Poncirus trifoliata  مزیت ISSR نسبت به RFLP و RAPD مشخص شد و همچنین در جنس Eleusine کیفیت و کمیت داده های بدست آمده از ISSR به RFLP و RAPD ارجحیت داشت (Reddy et al., 2002).

شناسایی ارقام Eucalyptus grandis توسط ISSR نشان داد که این نشانگر یک روش ارزان و سریع برای دسته بندی مناسب ارقام است (Mezzena et al., 2001). کارایی نشانگر ISSR در ژنوتیب های مهم سپیدار Jianming et al.,) 2006 (، سیب ( (Goulão & Oliveira, 2001 و Bitter gourd (Momordica charantia) (Singh et al., 2007) نیز نشان داده شده است.

در پژوهشی که با 30 واریته توت فرنگی از مناطق جغرافیایی مختلف انجام شد، نشان داده شد که این تکنیک نیاز به DNA با کیفیت بالا ندارد و در مقایسه با نتایج حاصل از AFLP، ارزان­تر، سریع­تر و قابل اعتمادتر می­باشد (Arnaud et al., 2000).

استفاده از نشانگر ISSR در گونه های Pyrus هم گزارش شده است. در یک تحقیق که از نتایج RAPD، AFLP و ISSR در شناسایی ارقام  P. communis استفاده شده بود، شاخص مرغوبیت[6] در ISSR (81/8) خیلی بالاتر از RAPD (06/2) بود و بیست و چهار رقم مورد آزمون را به خوبی دسته بندی کرد (Monte-Corro et al., 2002).

هشت آغازگر ISSR برای شناسایی ارقام گلابی اروپایی به کار رفته است. از 337 باند تولید شده %5/79 چندشکلی داشت Monte-Corro et al., 2001)). در تحقیقی برای شناسایی ارقام گلابی آسیایی از 16 آغازگر ISSR استفاده شد. چهل و چهار قطعه حاصل شد که ارقام مورد نظر را به خوبی از هم جدا می کرد. نتایج این تحقیق نشان داد، نشانگر ISSR در مقایسه با نشانگر RAPD چندشکلی بالاتری ایجاد می­کند .(Wang & Shih 2004)

مطالعه ژرم‌پلاسم گلابی با آگاهی از این که این میوه از نظر اقتصادی سومین میوه مهم منطقه معتدله پس از سیب و انگور است، ضروری به نظر می رسد. در سال های گذشته میراث ژنتیکی این جنس به سبب نابودی ارقام محلی، رو به فرسایش گذاشته است (Olivera et al., 1999). تولید گلابی دنیای امروز به تعداد محدودی از ارقام مانند ویلیامز، آنجو، بوره بوسک، کنفرنس و پاس کراسان وابسته است، که همگی در قرن 18 و 19 انتخاب شده اند. به همین دلیل نیاز مبرمی به مدیریت ژرم‌پلاسم و شناسایی واریته­های حفاظت شده گلابی برای بدست آوردن سطح کافی سرمایه ژنتیکی در برنامه‌های اصلاحی وجود دارد Wünsch & Hormaza 2007)).

کشور ما با سطح کشتی معادل 17000 هکتار و با عملکرد 114706 کیلوگرم در هکتار یکی از مراکز تولید گلابی محسوب می‌شود. ضمنا این کشور به سبب نزدیکی به مراکز تنوع گلابی و دارا بودن بیش از ده گونه از جنس Pyrus، به عنوان یکی از مهم‌ترین منابع ژنتیکی گلابی دنیا شناخته شده است .(Maniee, 1995) گونه‌های متعدد گلابی در دامنه های البرز و زاگرس، جلگه‌های پست ساحلی کنار دریای خزر، در استان های آذربایجان شرقی و غربی، کردستان، لرستان، کوه های بختیاری، منطقه طوالیش گیلان، مازندران، گرگان و همچنین در کوهستان های استان فارس پراکنده هستند (Sabeti, 2002). علی­رغم این موقعیت ممتاز جغرافیایی برای گلابی در ایران، هنوز اطلاعات دقیقی از روابط ژنتیکی بین ژنوتیپ‌های مختلف گلابی در ایران وجود ندارد و مشخص نیست ارقام بومی ایرانی چه نسبت شجره‌ای با ارقام تجارتی وارداتی دارند. کسب اطلاعات کافی در این زمینه می‌تواند به مدیریت صحیح این منابع ارزشمند ژنتیکی برای جلوگیری از انقراض ژرم‌پلاسم‌ها و بهره‌برداری مناسب از ژنوتیپ‌های محلی برای اهداف اصلاحی گلابی کمک نماید.

کسب اطلاعات کافی در این زمینه می‌تواند به بهره‌برداری مناسب از ژنوتیپ‌های محلی برای اهداف اصلاحی گلابی منجر شود. به علاوه، این اطلاعات به یافتن منشأ جغرافیایی برخی ارقام تجاری کشور که نیای ژنتیکی آنها مشخص نیست، کمک می کند. در هر حال برای برنامه ریزی در اصلاح ژنوتیپ‌های گلابی، داشتن اطلاعات کافی از زمینه ژنتیکی هر رقم و تعیین موقعیت فیلوژنتیکی ارقام نسبت به یکدیگر اهمیت اساسی دارد. ضمنا گاهی ارقامی مشابه با نام­های محلی متفاوت خوانده می شوند. مقایسه ارقام ایرانی با ارقام خارجی امکان شناسایی چنین اشتباهاتی را فراهم می کند. ضمن این که مشخص می­کند ارقام ایرانی چه نسبت ژنتیکی با ارقام تجارتی وارداتی دارند و آیا آنقدر زمینه ژنتیکی متفاوتی دارند که ارزش بررسی برای ژن های جدید (ژن های مقاومت به بیماری­ها و یا تنش­ها) در برنامه های اصلاحی را داشته باشند.

چون در مطالعات ژنتیکی انجام شده روی گلابی و سایر گیاهان توسط پژوهش‌گران دیگر، کارایی نشانگرهای ISSR به اثبات رسیده بود، لذا این نشانگرها برای تأمین اهداف این پژوهش، تعیین روابط فیلوژنتیکی ارقام گلابی ایران و مقایسه آنها با ارقام خارجی، انتخاب گردیدند.

 

مواد و روش‌ها

نمونه های برگ گلابی شامل 13 رقم خارجی و 10 رقم ایرانی (جدول 1)، از مؤسسه اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج جمع آوری شدند. نمونه­های انتخابی از میان ژنوتیپ هایی بود که کشت آنها مرسوم است. به علاوه چند ژنوتیپ وحشی جهت بررسی منشا ارقام تجاری استفاده گردید. نمونه های برگی بعد از انجماد سریع با نیتروژن مایع، تا زمان انجام استخراج DNA ژنومی در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

استخراج DNA از برگ های جوان گلابی با روش  Murray and Thompson, 1980) ) انجام گرفت. برای تعیین کمیت و کیفیت DNA از روش الکتروفورز پنج میکرولیتر از  DNA‌به دست آمده در ژل آگاروز %7/0 در بافر TAE[7] (حاوی 10 میلی مولار تریس، 5/0 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید و 5 میلی مولار استات سدیم) و مقایسه تراکم باند آن با مقدار استاندارد قطعات نشانگر III (λDNA برش یافته با آنزیم‌‌های برشی EcoRI و Hind III) استفاده شد.

آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این تحقیق توسط شرکت Metabion International (Germany) سنتز شد. در جدول 2 توالی این آغازگرها به همراه دمای اتصال مناسب برای هر آغازگر آورده شده است. آغازگرها طبق دستور شرکت تولیدکننده تا غلظت pmol/µL10 رقیق گردید. با استفاده از PCR گرادیانت تکثیر آغازگرها در سه دمای اتصال مختلف بررسی گردید و دمای مناسب انتخاب شد که در جدول 2 مشاهده می­شود.

واکنش PCR برای نمونه‌ها در حجم 15 میکرولیتر شامل 5/1 میکرولیتر بافر X10 (حاوی کلریدمنیزیم 5/1 میلی مولار)، 3/0 میکرولیتر  Taq DNA Polymerase (1 واحد)، 5/1 میکرولیتر از هر آغازگر (با غلظت pmol/µL10)، 3/0 میکرولیتر dNTPs (2/0 میلی مولار) و 75 نانوگرم DNA ژنومی از هر نمونه تهیه شد.

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- ارقام گلابی مورد استفاده در تحقیق (ارقام خوج کته سر، خوج مرداب انزلی، کولی خوج وخوج لب ترش جزو ارقام وحشی می باشند. سایر ارقام تجاری هستند).

Table 1- Pear varieties used in study (Khuj katesar, KoliKhuj, Khuj mordab anzali and Khuj labtorsh accessions are Wild genotypes and other cultivars are commercial).

ردیف

Row

نام فارسی

Farsi name

نام انگلیسی

English name

کد نمونه‌ها

cod

مبدأ

source

گونه

species

1

آنجو

Anjou

Anj

فرانسه

Pyrus communis

2

ویلیامز

Williams

Wil

انگلستان

P. communis

3

دوین دوکومیس

Doyenneducomice

Doy

فرانسه

P. communis

4

هراسوئیت

Harrow Sweet

Har

کانادا

P. communis

5

کنفرنس

Conference

Con

انگلستان

P. communis

6

دوشس

Duchesse

Duc

فرانسه

P. communis

7

لیس بن

Lies Bonne

Lie

فرانسه

P. communis

8

آبت فتل

Abate Fetel

Aba

فرانسه

P. communis

9

فلسطینی

Palestine

Pal

فرانسه

P. communis

10

ردبارتلت

Red Bartlett

Red

انگلستان

P. communis

11

پاس کراسان

Pass Crassane

Pas

فرانسه

P. communis

12

-

SK10

S10

ژاپن

P. pyrifolia

13

-

SK13

S13

ژاپن

P. pyrifolia

14

خوج کته سر

Khuj katesar

Kkat

ایران

P. communis

15

خوج مرداب انزلی

Khuj mordab anzali

Kmor

ایران

P. communis

16

کولی خوج

KoliKhuj

KolK

ایران

P. communis

17

سبری

Sebri

Seb

ایران

-

18

شاه میوه

Shah miveh

Shah

ایران

P. communis

19

خوج لب ترش

Khuj labtorsh

Klab

ایران

P. communis

20

دم کج

Dom Kaj

Dom

ایران

P. communis

21

دره گزی

Daregazi

Dar

ایران

P. communis

22

محمد علی

Mohammad Ali

Moh

ایران

P. communis

23

سردرودی

Sardroudi

Sar

ایران

P. communis

 


 


جدول 2- آغازگرهای ISSR استفاده شده در تحقیق.

Table 2- ISSR primers used in study.

ردیف

Row

توالی آغازگر

Primer sequence (5’-3’)

دمای اتصال ( oC)

Annealing temp.

1

(AC)8YG

50

2

(GA)8YC

50

3

BDB(CAC)5

55

4

HVH(TGT)5

51

5

VBV(AC)7

49

6

(AGTG)4

50

7

(CA)8GT

54

8

(AC)8YT

53

9

(AC)8YA

54

10

(GT)8YC

54

11

(GT)8C

52

12

(GATA)5

49

13

(TCT)6

49

14

HBH(CT)7

54

15

(TC)8RG

54

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Y = T یا C                       D = A یا G یا T                               H = A یا C یا T

R = A یا G                      B = G یا C یا T                                 V = A یا C یا G

 

 

 

پس از اضافه کردن یک قطره روغن معدنی استریل به هر نمونه، لوله‌ها در دستگاه ترموسایکلر (gradient-Maste cycler Eppendorf) قرار گرفتند که در آن آنجام واکنش PCR به صورت یک چرخه واسرشت سازی[8] اولیه در 94 درجه سانتی گراد به مدت دو دقیقه، 33 چرخه شامل واسرشت سازی ثانویه در 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها[9] به رشته DNA در دمای بهینه شده برای هر آغازگر (جدول 2) به مدت 45 ثانیه و تکثیر قطعات[10] DNA در دمای 72  درجه سانتی گراد به مدت 100 ثانیه و نیز یک چرخه تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت پنج دقیقه، برنامه ریزی شد.

مقدار 6 میکرولیتر از محصول PCR با مقدار 2 میکرولیتر از بافر بارگذاری[11] مخلوط شد. مقدار پنج میکرولیتر از آن در یک چاهک ژل آگارز 2 درصد در بافر TBE (حاوی 90 میلی مولار تریس، 90 میلی مولار اسید بوریک و دو میلی مولار اتیلن دی آمین تترااستیک اسید) بار گذاری شد. سه میکرولیتر نشانگر اندازه 50 (از شرکت Fermentas) نیز به عنوان نشانگر جهت تخمین اندازه قطعات DNA تکثیر شده تزریق شد و به مدت 8 ساعت با ولتاژ 80 الکتروفورز گردید. جهت نمایان کردن قطعات DNA در ژل، از رنگ آمیزی به روش اتیدیوم بروماید[12] (mg/L 5/0) استفاده شد.

وجود یا عدم وجود باندها با اعداد یک و صفر برای هر رقم مشخص شد. داده های گم شده با عدد 9 رتبه­دهی گردید. به دلیل ماهیت غالب نشانگرهای ISSR از نرم افزار V.Pc-2.02e NTSYS برای رسم درخت فیلوژنتیکی استفاده گردید. تجزیه و تحلیل داده ها شامل تشکیل ماتریس تشابه، تجزیه خوشه انجام شد. همچنین با استفاده از این نرم افزاز پارامتر محتوای اطلاعات چندشکلی[13](PIC) محاسبه شد. مقادیر  PIC  بر پایه رابطه PIC = 1-∑nj Pij 2 محاسبه گردید (Roldan-Ruize et al., 2000)، که در آن pij فراوانی الگوی j برای نشانگر i است که برای n الگو جمع زده می­شود. همچنین ضریب همبستگی کوفنتیک محاسبه و آزمون مانتل (Mantel, 1967) برای ارزیابی همبستگی بین ماتریسهای تشابه و دندروگرام نهایی، بر پایه ضریب تشابه جاکارد، دایس و تطابق ساده انجام شد. درنهایت دندروگرام به دست آمده از گروه­بندی نمونه ها، بر اساس روش دایس و  روش اتصال میانگین[14] (UPGMA) تهیه شد.

 


نتایج و بحث

پانزده آغازگر ISSR به کار رفته توانستند در همه 23 رقم گلابی مطالعه شده، به جز موتانت­ها، تکثیر قابل تشخیصی داشته باشند. در کل 257 باند مشاهده شد که 6/81 درصد آن­ها، یعنی 213 باند، چند شکلی نشان دادند. درجه چند شکلی به دست آمده بالاتر از درصد چند شکلی حاصل از RAPD (%74) و AFLP (%75) در مطالعه 25 رقم گلابی بود et al., 2000)  (Monta–Corvo. چنین به نظر می‌رسد نشانگر ISSR‌ چندشکلی بالاتری از این دو نشانگر ایجاد می‌کند. به علاوه، چندشکلی حاصل طبیعت خود ناسازگار گلابی را نیز اثبات می‌نماید.

نتایج به دست آمده از هر آغازگر در جدول 3 خلاصه شده است. تعداد باندهای چند شکلی از 5 باند در نشانگر 5(GATA) تا 21 باند چندشکل در نشانگرهای 8YA(AC) و HBH(CT)7 متغیر بود. به این ترتیب متوسط آلل‌های تولیدشده برای هر آغازگر 2/14 باند چندشکل بود. محدوده قطعات تکثیر شده از 200 تا 1400 جفت باز بود. الگوی تکثیر دو آغازگر (GA)8YC و (CA)8GT به عنوان مثال در شکل‌های 1 و 2 نشان داده شده است.


 

 

جدول 3- لیست آغازگرهای ISSR مورد استفاده در این تحقیق.

Table 3- The name of ISSR primers used in study.

ردیف

Row

آغازگر

primer

تعداد باندهای مشاهده شده

Number of bands

تعداد باندهای چندشکل

Numberof polymorphism band

درصد باندهای پلی مورف

Percent of polymorphism band

محتوای اطلاعات چند شکلی

PIC

1

(AGTG)4

9

8

88.88

0.22

2

(GATA)5

7

5

71.45

0.18

3

(TCT)6

10

8

80

0.37

4

(AC)8YG

20

15

75

0.39

5

(GA)8YC

12

11

91.66

0.30

6

(CA)8GT

16

15

93.78

0.30

7

(AC)8YT

21

18

85.71

0.26

8

(AC)8YA

25

21

84

0.45

9

(GT)8YC

15

13

86.66

0.28

10

(GT)8C

18

14

77.77

0.29

11

(TC)8RG

15

10

66.66

0.28

12

BDB(CAC)5

21

18

85.71

0.39

13

HVH(TGT)5

18

17

94.44

0.38

14

VBV(AC)7

22

19

67.82

0.39

15

HBH(CT)7

28

21

75

0.43

 

mean

17.13

14.2

81.6

 

 

total

257

213

 

 

 

 

شکل 1- الگوی باندی ISSR حاصل از تکثیرآغازگر (CA)8GT روی ارقام مختلف گلابی )ژل آگاروز دو درصد، رنگ آمیزی اتیدیوم برماید).

Figure 1- ISSR band- pattern of pear genotypes analyzed with the (CA)8GT marker (Ethidium bromide-stained  2% agarose gel).

 

 

شکل 2- الگوی باندی ISSR حاصل از تکثیر آغازگر(GA)8YC  روی ارقام مختلف گلابی (ژل آگارز 2 درصد، رنگ آمیزی اتیدیوم برماید).

M: نشانگر اندازه جفت بازی100، 1-کنفرنس، 2-دوشس، 3-لوئیس بن، 4-SK10، 5-آبت فتال، 6-بارتلت، 7-ردبارتلت، 8-پاس‌کراسان، 9-دوین دوکومیس، 10-آنجو، 11-SK13 ، 12-هراسویت، 13- فلسطینی، 14-سردرودی، 15-محمدعلی، 16-دره‌گزی، 17-سبری، 18-دم کج، 19-خوج مرداب انزلی، 20-خوج لب ترش، 21-شاه میوه، 22-خوج کته‌سر، 23-کولی‌خوج.

Figure 1- ISSR band- pattern of pear genotypes analyzed with the (GA)8YC marker (Ethidium bromide-stained  2% agarose gel).

M: 100 bp DNA Ladder. 1—Conference, 2- Duchesse, 3- Lies Bonne, 4- SK10-4, 5- Abate Fetel, 6- Bartlett,7- Red Bartlett, 8- Pass Crassane, 9- Doyenneducomice, 10- Anjou, 11- SK13, 12- Harrow Sweet, 13- Palestine, 14- Sardrood, 15- Mohammad Ali, 16- Daregazi, 17- Sebri, 18- Dom Kaj, 19- Khuj mordab anzali, 20- Khuj labtorsh, 21- Shah miveh, 22- Khuj katesar, 23- KoliKhuj.   

 

 

مطالعات نشان می‌دهد آغازگر های ISSR دارای تکرار های AG ،GA ،CT ،TC ،AC ،CA چند شکلی بالاتری از سایر تکرار های دی، تری و تترانوکلئوتیدی نشان می­دهند
et al., 2002) (Reddy. نتایج به دست آمده در این تحقیق نیز با این فرضیه مطابقت داشت. به طوری که آغازگرهای (AC)8YA و HBH(CT)7 با تولید 21 باند چندشکل بیشترین چندشکلی را نشان دادند. همان طور که انتظار می‌رفت، آغازگرهای فاقد باز اضافی تری و تترا نوکلئوتیدی (TCT)6، (GATA)5 و (AGTG)4 کمترین میزان باندهای چند شکل (متوسط هفت) را تولید نمودند. زیرا این تکرار ها در طول ژنوم به نسبت تکرار های دی نوکلئوتیدی کمتر دیده می‌شوند و استفاده از آنها در نشانگرهایISSR  کم اهمیت تر از دی نوکلئوتید ها است (Katti et al., 2001). در مطالعه دیگری که روی 24 رقم گلابی با استفاده از نشانگر ISSR انجام شده بود، ثابت شد که آغازگرهای حاوی تکرارهای دی نوکلئوتیدی از آغازگرهای حاوی تکرارهای تری، تترا و پنتانوکلئوتیدی بازده بیشتری دارند و استفاده از آنها بیشتر توصیه شده است
et al., 2001) (Monte-corvo. مطالعه ای هم که روی برنج (Oryza sative) انجام گرفت همین نتایج را اثبات نمود
 et al ., 2001) (Monte-corvo. در نتایج حاصل از تحقیق حاضر معمولاً بیشترین تعداد باندهای مشاهده شده به آغازگرهایی که حاوی تکرار دی نوکلئوتیدی AC هستند مربوط می‌شود. بر این اساس، به نظر می‌رسد که تکرار دی نوکلئوتیدی AC در ژنوم گلابی بیشتر وجود دارد. از این نتایج می توان در طراحی آغازگرهای ریزماهواره برای گلابی استفاده نمود. در مطالعات مربوط به تنوع ژنتیکی گندم نانوایی و سیب زمینی هم نشان داده شد آغازگرهای حاوی تکرارAC در مقایسه با سایر آغازگرهای ISSR، بازده بیشتری دارند (Reddy et al., 2002). بررسی ژنوم گندم ماکارونی با نشانگر ISSR هم حضور بالای تکرارهای AC را تأیید می­کند (Reddy et al., 2002).

در میان آغازگرهای دارای باز اضافی در جهت '5، آغازگرهای  BDB(CAC)5 و HVH(TGT)5 باندهایی با وزن مولکولی بالا (بالاتر از 1000 جفت باز) تکثیر کردند که امتیازدهی آنها مشکل بود. قبلاً هم در مطالعه ژنوم جو، فشردگی باندها در قسمت بالای ژل آغازگرهای دارای باز اضافی در جهت '5 گزارش داده شده بود (Monte-corvo et al., 2002). در تحقیقی که برای تعیین تنوع ژنتیکی 20 رقم گلابی با استفاده از آغازگرهای ISSR صورت گرفت، حضور باندهایی با طول بالای 800 جفت باز در مورد آغازگرهای HVH(TG)7، DBD(AC)7، DBD(AC)7  و HVH(CA)7 مشاهده شد (Reddy et al., 2002). از آنجایی که نواحی تکثیر شده توسط آغازگرهای لنگرشده در جهت '5 شامل مناطق بین ریزماهواره ها و توالی‌های ریزماهواره‌ای هستند، ایجاد محصولات با طول بزرگ تر از محصولات سایر آغازگرها که شامل مناطق بین ریزماهواره‌ای هستند، منطقی به نظر می‌رسد(Reddy et al., 2002).

ضریب تشابه از صفر تا یک متغیر است. زمانی که نشانگرها برای دو رقم کاملاً یکسان باشند، ضریب تشابه یک می‌شود و صفر حالتی است که تمام نشانگرها برای دو ژنوتیپ کاملاً متفاوت باشند. دامنه ضریب تشابه به دست آمده از نشانگرهای ISSR در این تحقیق از 05/0 بین ارقام دره گزی و SK13 تا یک بین دو رقم ردبارتلت و بارتلت متغیر بود.

برای انتخاب مناسب ترین الگوریتم جهت دسته‌بندی ارقام از ضریب همبستگی کوفنتیک (824/0=r) استفاده شد. بهترین روش انتخاب شده روش UPGMA بود و دندروگرام بر اساس این روش ترسیم گردید (شکل 3).  براساس دندروگرام حاصله در شباهت ژنتیکی 36/0 نمونه­های مورد بررسی،  به سه دسته و یک ژنوتیپ مستقل تقسیم شد. در گروه اول کنفرنس، محمدعلی، سردرودی، بارتلت، ردبارتلت، هراسویت، پاس‌کراسان، دوین دوکومیس، آنجو، فلسطینی، لوئیس‌بن، دوشس و دره‌گزی، در گروه دوم کولی خوج، خوج لب ترش، خوج کته سر، دم کج، سبری، خوج مرداب انزلی و شاه‌میوه و در گروه سوم SK10 و SK13 قرار گرفتند. ژنوتیپ آبت فتال به صورت مستقل از بقیه گلابی‌ها قرار گرفت.

همه ارقام غرب اروپا در دسته اول قرار گرفتند. حضور سه رقم ایرانی محمدعلی، سردرودی و دره‌گزی در این دسته نشان می‌دهد که این سه رقم نزدیکی زیادی با ارقام اروپایی دارند و به احتمال زیاد از اجداد مشترکی اشتقاق پیدا کرده اند. در این دسته بارتلت و ردبارتلت با شباهت کامل (ضریب تشابه یک) از هم تفکیک نشدند. رقم گلابی هراسویت نیز با اجداد خود بارتلت و ردبارتلت در یک زیردسته قرار گرفت. ژنوتیپ گلابی ایرانی دره‌گزی همراه با لوئیس بن و دوشس که ارقامی از فرانسه هستند به یک زیر دسته دیگر تعلق یافتند. ارقام محمدعلی و سردرودی نیز در مقایسه با دره‌گزی شباهت بیشتری به هم نشان دادند که به تأیید این فرضیه کمک می‌کند که آنها جد مشترکی دارند.

در دسته دوم ژنوتیپ‌های کولی خوج و خوج لب ترش از سایر ارقام ایرانی جدا شدند که شاید دلیلی بر زمینه ژنتیکی متنوع تر این دو رقم باشد. سایر خوج ها و ارقام تجارتی سبری، شاه‌میوه و دم کج فاصله ژنتیکی کمتری از هم داشتند. سبری که به نظر عده‌ای جزو ارقام گلابی‌های آسیایی است (Sabeti, 2002; Maniee, 1995)، در دسته خوج ها قرار گرفته بود و به احتمال قوی متعلق به گونه P. communis است.

دسته سوم شامل دو رقم ژاپنی SK10 و SK13 از گونه P. pyrifolia بود. این دو رقم کاملاً از سایر ارقام که همگی متعلق به گونه P. communis هستند جدا شده اند. اگر رقم سبری متعلق به گلابی های ژاپنی بود، انتظار می‌رفت در این دسته قرار گیرد در حالی که چنین اتفاقی نیفتاد.

در دندروگرام حاصل، رقم آبت فتال از سایر ارقام فرانسوی جدا شد و به صورت یک شاخه تنها قرار گرفت. قرارگیری دور از انتظار آبت فتال شاید به ماهیت نشانگرهای ISSR مربوط باشد لذا این نتیجه دور از انتظار باید مورد بررسی مجدد قرار گیرد.

ارقام شاه‌میوه، دم کج و سبری با ارقام وحشی خوج (خوج لب ترش، کولی خوج، خوج مرداب انزلی و خوج کته سر) در یک دسته قرار گرفتند که نشان داد احتمالاٌ این سه رقم تجارتی از ژنوتیپ‌های خوج‌ها، که در مناطق شمالی کشور پراکنده‌اند، مشتق شده‌اند و بعداً به قسمت مرکزی ایران وارد شده‌اند. سه رقم محمدعلی، سردرودی و دره‌گزی نزدیکی زیادی با ارقام اروپایی نشان دادند و در گروهی متفاوت از ارقام ایرانی قرار گرفتند. این یافته به تأیید این فرضیه کمک می‌کند که ارقام مزبور به احتمال زیاد با ارقام اروپایی اجداد مشترکی دارند. به علاوه ارقام محمدعلی و سردرودی نزدیکی قابل توجهی نشان دادند. با توجه به این که منشأ رقم سردرودی آذربایجان است، می‌توان احتمال داد رقم محمدعلی و سردرودی هر دو جزو ارقامی باشند که از ناحیه قفقاز وارد ایران شده اند.


 

شکل 3- دندروگرام ژنوتیپ های گلابی مورد بررسی بر اساس الگو های باندی ISSR، با استفاده از ضریب تشابه دایس و روش UPGMA. کد نمونه‌ها بر اساس جدول 2-1 انتخاب شده است

Figure 3- Phenogram for the 23 genotypes of pear evaluated in this study, using the UPGMA method and Dice Similarity Matrix between varieties. samples Code selected according to Table 1-2.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع

Arnaud G, Lallemand J, Bourgoin M (2000). ISSR versus AFLP for variety identification. Plant and Animal Genome VШ Conference, San Diego, CA. PP. 552.

Atar A (2001). Specification of Europe and U.S. commercial cultivars of apple and pear. Publication of Agricultural Education 70P

Bassil NV, Neou C and Postman J (2005). EST-SSR utility in managing the pear collection at the national germplasm repository. Plant and Animal genome XIII conference, San Diego, CA. pp. 134.

Bassil NV, Postman JD, Neou C (2004). Pyrus microsatellite markers from gene bank sequences. Acta Horticulturae 671: 42.

Bell RL (1990). Pears (pyrus) Genetic resources of temperate fruit and nut crops In: J. N. Moore and J. R. Ballington (Eds), I. International society for horticultural science, wageningen, the Netherland 665-697.

Bell RL, Hough LF (1986). Interspecific hybridization of pyrus., Horticultural science 21: 62-64.

     Bornat B, Branchard M (2001). Nonanchored inters simple sequence repeat (ISSR) markers: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter 19: 209-215.

Chenneaui-Kourda H, Marghali S, Marrakchi M, Trif-Farah N (2007). Genetic diversity of sulla genus (Hedysarea) and related species using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Biochemical Systematic and Ecology 35:682-688.

Dolatowski J, Nowosielski J, Podyma W, Szymanska M , Zych M (2004). Molecular studies on the variability of polish semi-wild pears (Pyrus) using AFLP. Fruit Ornamental Plant Research 12: 22-26.

Fernández-Fernandez F, Harvey NG, James CM (2006).  Isolation and characterization of polymorphic microsatellite markers from European pear (Pyrus communis). Molecular Ecology Notes 6(4): 1036-1041.

Ghosh AK, Lukens LN, Lukens DM, Hunter DM , Strommer JN (2006). European and Asian pears: simple sequence repeat–polyacrilamide gel electrophoresis-based analysis of commercially important North American cultivars. Horticultural Science 41: 304-309.

Goulão L, Oliveira CM (2001). Molecular characterization of cultivars of apple (Malus domestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers. Euphytica 122: 81-89.

Iketani H, Manabe T, Matsuta N, Akihama T, Hayashi T (1998). Incongruence between RFLPs of chloroplast DNA and morphological classification in east Asian pear (Pyrus spp.). Genetic Resources and Crop Evolution 45:533-539

Inoue E, Matsuki Y, Anzai H , Evans K (2007). Isolation and characterization of microsatellite markers in Japanese pear (Pyrus pyrifolia). Molecular Ecology Notes 7:445-447.

Jianming G, Shougong Z, Liwang Q, Yong Z ,Chunguo W (2006). ISSR and AFLP identification and genetic relationships accessions from the genus Populus. Annals of Forest Science 63: 499-506.

 JianXin N, Gany MB, Lizhong P, Jian Rong F , Yan LX (2004). Study on the genetic relationships among 18 pears cultivars by RAPD. Journal of Fruit Science 21: 521-525.

Katti MV, Ranjeker RK, Gupta VS (2001). Differential distribution of simple sequence repeats in Eukaryotic genome sequences. Molecular Biology and Evolution 18: 1161-1167.

Kimura T, Ban Y, Yamamoto T, Shi YZ,  Kotobuki K, Matsuta N, Hayash T (1999). The Japanese pear genome program I. Development of SSR markers and identification of pears. Acta Horticulturae 587: 237-242.

Kimura T, Yamamoto T, Mochida K, Lmai T, Matsuta N, Ban Y, Hayashi T(2002). Development and mapping of SSR markers in peach and pear. Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference, San Diego, CA. 191-206.

Maniee A (1995). Pear and Foster and their training.  Technical publication of Iran 50p

Mantel N (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27: 209-220

Mezzena L, Paris A, Gimene M As, Bonine C, Valle CF( 2001). Identification of ISSR (inter simple sequence repeat) codominant markers in Eucalyptus grandis. Plant and Animal Genome IX Conference San Diego, CA. P24.

Monta–Corvo L, Caberita L, Leitao J (2000). Assessment of genetic relationships among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution 47 : 257-265.

Monte-Corro L, Goulão L, Oliveira C (2002). Discrimination of pear cultivars with RAPD, AFLP and ISSR. Acta Horticulturae 596: 187-191.

Monte-corvo L, Goulão L , Oliveira C ( 2001). ISSR analysis of cultivars of pear and suitability of molecular markers for clone discrimination. Journal of the American Society for Horticultural Science 126(5): 517-522.

Murray GC and Thompson WF(1980) Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucleic Acid Research. 8: 4321–4325.

Olivera CM, Mota M, Monte-Corvo L, goulão L, Silva DM (1999). Molecular typing of Pyrus based on RAPD markers. Scientia Horticulturae Amsterdam 79: 163-174.

Pan Z, Kawabata S, Sugiyama N, Sakiyama R, Cao Y (2002). Genetic diversity of cultivated resources of pear in north china. Acta Horticulturae 587: 187-194.

Reddy MP, Sarla N, Siddiq EA (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica 128: 9-17.

Roldan-Ruize I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, Vaneijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties. 2. AFLP characterization. Molecular Breeding 6:593-602

Sabeti H (2002). Forests, trees, and shrubs of Iran.  Puplication of Tehran Research Center and Natural Resources.   

Sharifani, MM, Jackson JF (2000). Characterization of pear species and cultivars using RAPD primers. Acta Horiculturae 538: 499-504.

Singh, AK, Behera TK, Chandel D, Sharma P, Singh NK ( 2007). Assessing genetic relationships among bitter gourd (Momordica charantia L.) accessions using inter simple sequence repeat (ISSR) markers. Journal of Horticultural and Science and Biotechnology 82: 217-222.

Vejdani M (1997). Importance of safeguarding procedures in  the natural growth and its rolls in Preservation and Operation of Reserve plant inheritance. Proceeding of the 4th Iranian Congress of Crop Science, Esfahan pp 554-573.

Wang JY, Shih JC (2004) Molecular for fingerprinting cultivar of oriental pear (Pyrus pyrifolia Scientia Horticulturae Amsterdam 107: 441-421.

Wünsch A, Hormaza JI (2007). Characterization of variability and genetic similarity of European pear using microsatellite loci developed in apple. Scientia Horticulturae Amsterdam 113: 37-43.

Wünsch A, Hormaza JI (2002). Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers. Euphytica 125: 59-67.

Yamamoto T, Kimura T, Sawamura Y, Ban Y, Aayashi T, Matsuta N (2001). SSRs isolated from apple can identify polymorphism and genetic diversity in pear. Theoretical and Applied Genetics 102: 865-870.

Yamamoto T, Kimura T, Sawamura Y, Manabe T, Kotobuki K, Hayashi T, Ban Y, Mastuta N ( 2002). Simple sequence repeats for genetic analysis in pear. Euphytica, 124: 129-137.

Ye G N, Hemmat M, Lodhi MA, Weeden NF and Reisch BI ( 1996). Long primers for RAPD mapping and fingerprinting of grape and pear. Bio Techniques 20: 368-371.

 


Determination of genetic diversity in pear genotypes using ISSR markers

 

Safarpoor Shorbakhlo M.1, Hosseini Monfared R.2, Paydar S.1, Sharifi M.*1

 

1 Fars Agricultural and Natural Resources Research Center

2 Graduated students Islamic Azad University, Arsenjan Branch

 

Abstract

Iran is known as one of the most important pear genetic resources because of being near to the pear diversity centers and having more than 10 species of genus Pyrus. On the other hand, Iran with acreage of 17,000 hectares, is one of the pear production centers .Despite its unique geographical location, there is no sufficient genetic information among pear germplasm in Iran and it is not clear what genetic relationship is between Iranian local genotypes and imported genotypes. In this study, Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers was used for clustering  of 10 Iranian Pear genotypes and positioning  of their genetic variation among 13 imported genotypes. Fifteen ISSR primers were screened that yielded a total of 257 amplified products, of which 213 bands (81.6%) were polymorphic. Dendrogram of pear cultivars with ISSR banding patterns was drawn with NTSYS V. Pc-2.02e software using Dice coefficient and UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Average), method .The 23 genotypes of pear were clustered in to three groups. The first group includes Conference, Mohammad Ali, Sardroudi, Bartlett, Red Bartlett, Harrow Sweet, Pass Crassane, Doyenneducomice, Anjou, Palestine,Lies Bonne, Duchesse and Daregazi. Kolikhaj, Sebri, Khuj labtorsh, Dom kaj, Khuj Katesar, Khuj Mordab Anzali and Shah Miveh belong to the second group. The third group includes SK10 and SK13. Cultivars were classified according to the geographical origin and the figures belonging to P. communis and P. pyrifolia, were completely separated. Iranian commercial cultivars including: Dom kaj, Shah miveh, Sebri with different Khuj accessions were placed in a group, that seems that thay have originated from different Khuj. While the three cultivars: Mohammad Ali, Sard roudi and Daregazi revealed closer to the European figures and possibility they have different origin than different Khuj And have a common ancestor with European figures. The results of this study indicate that ISSR markers have higher level of discrimination in evaluating genetic diversity and fingerprinting of pear genotypes.

Keywords: Genetic diversity, ISSR markers, Pear.


 



* نویسنده مسئول: مستانه شریفی                         تلفن: 07124222425                               Email: sharifi_m2002@yahoo.com

 

[2] Self-Incompatible

[3] Oriental pear

[4] Introgression

[5] Sweet Potato

[6] Index Value

[7] Triss-Acetate-EDTA

[8] Denaturing

[9]Annealing

[10] Extension

[11] Loading buffer                                               

[12] Ethidium bromide

[13] Polymorphic Information Content (PIC)

[14] Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA)

* Corresponding Author: Sharifi M.           Tel: 07124222425                 Email: sharifi_m2002@yahoo.com

Arnaud G, Lallemand J, Bourgoin M (2000). ISSR versus AFLP for variety identification. Plant and Animal Genome VШ Conference, San Diego, CA. PP. 552.
Atar A (2001). Specification of Europe and U.S. commercial cultivars of apple and pear. Publication of Agricultural Education 70P
Bassil NV, Neou C and Postman J (2005). EST-SSR utility in managing the pear collection at the national germplasm repository. Plant and Animal genome XIII conference, San Diego, CA. pp. 134.
Bassil NV, Postman JD, Neou C (2004). Pyrus microsatellite markers from gene bank sequences. Acta Horticulturae 671: 42.
Bell RL (1990). Pears (pyrus) Genetic resources of temperate fruit and nut crops In: J. N. Moore and J. R. Ballington (Eds), I. International society for horticultural science, wageningen, the Netherland 665-697.
Bell RL, Hough LF (1986). Interspecific hybridization of pyrus., Horticultural science 21: 62-64.
     Bornat B, Branchard M (2001). Nonanchored inters simple sequence repeat (ISSR) markers: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter 19: 209-215.
Chenneaui-Kourda H, Marghali S, Marrakchi M, Trif-Farah N (2007). Genetic diversity of sulla genus (Hedysarea) and related species using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Biochemical Systematic and Ecology 35:682-688.
Dolatowski J, Nowosielski J, Podyma W, Szymanska M , Zych M (2004). Molecular studies on the variability of polish semi-wild pears (Pyrus) using AFLP. Fruit Ornamental Plant Research 12: 22-26.
Fernández-Fernandez F, Harvey NG, James CM (2006).  Isolation and characterization of polymorphic microsatellite markers from European pear (Pyrus communis). Molecular Ecology Notes 6(4): 1036-1041.
Ghosh AK, Lukens LN, Lukens DM, Hunter DM , Strommer JN (2006). European and Asian pears: simple sequence repeat–polyacrilamide gel electrophoresis-based analysis of commercially important North American cultivars. Horticultural Science 41: 304-309.
Goulão L, Oliveira CM (2001). Molecular characterization of cultivars of apple (Malus domestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers. Euphytica 122: 81-89.
Iketani H, Manabe T, Matsuta N, Akihama T, Hayashi T (1998). Incongruence between RFLPs of chloroplast DNA and morphological classification in east Asian pear (Pyrus spp.). Genetic Resources and Crop Evolution 45:533-539
Inoue E, Matsuki Y, Anzai H , Evans K (2007). Isolation and characterization of microsatellite markers in Japanese pear (Pyrus pyrifolia). Molecular Ecology Notes 7:445-447.
Jianming G, Shougong Z, Liwang Q, Yong Z ,Chunguo W (2006). ISSR and AFLP identification and genetic relationships accessions from the genus Populus. Annals of Forest Science 63: 499-506.
 JianXin N, Gany MB, Lizhong P, Jian Rong F , Yan LX (2004). Study on the genetic relationships among 18 pears cultivars by RAPD. Journal of Fruit Science 21: 521-525.
Katti MV, Ranjeker RK, Gupta VS (2001). Differential distribution of simple sequence repeats in Eukaryotic genome sequences. Molecular Biology and Evolution 18: 1161-1167.
Kimura T, Ban Y, Yamamoto T, Shi YZ,  Kotobuki K, Matsuta N, Hayash T (1999). The Japanese pear genome program I. Development of SSR markers and identification of pears. Acta Horticulturae 587: 237-242.
Kimura T, Yamamoto T, Mochida K, Lmai T, Matsuta N, Ban Y, Hayashi T(2002). Development and mapping of SSR markers in peach and pear. Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference, San Diego, CA. 191-206.
Maniee A (1995). Pear and Foster and their training.  Technical publication of Iran 50p
Mantel N (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27: 209-220
Mezzena L, Paris A, Gimene M As, Bonine C, Valle CF( 2001). Identification of ISSR (inter simple sequence repeat) codominant markers in Eucalyptus grandis. Plant and Animal Genome IX Conference San Diego, CA. P24.
Monta–Corvo L, Caberita L, Leitao J (2000). Assessment of genetic relationships among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution 47 : 257-265.
Monte-Corro L, Goulão L, Oliveira C (2002). Discrimination of pear cultivars with RAPD, AFLP and ISSR. Acta Horticulturae 596: 187-191.
Monte-corvo L, Goulão L , Oliveira C ( 2001). ISSR analysis of cultivars of pear and suitability of molecular markers for clone discrimination. Journal of the American Society for Horticultural Science 126(5): 517-522.
Murray GC and Thompson WF(1980) Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucleic Acid Research. 8: 4321–4325.
Olivera CM, Mota M, Monte-Corvo L, goulão L, Silva DM (1999). Molecular typing of Pyrus based on RAPD markers. Scientia Horticulturae Amsterdam 79: 163-174.
Pan Z, Kawabata S, Sugiyama N, Sakiyama R, Cao Y (2002). Genetic diversity of cultivated resources of pear in north china. Acta Horticulturae 587: 187-194.
Reddy MP, Sarla N, Siddiq EA (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica 128: 9-17.
Roldan-Ruize I, Calsyn E, Gilliand TJ, Coll R, Vaneijk MJT, De Loose M (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties. 2. AFLP characterization. Molecular Breeding 6:593-602
Sabeti H (2002). Forests, trees, and shrubs of Iran.  Puplication of Tehran Research Center and Natural Resources.   
Sharifani, MM, Jackson JF (2000). Characterization of pear species and cultivars using RAPD primers. Acta Horiculturae 538: 499-504.
Singh, AK, Behera TK, Chandel D, Sharma P, Singh NK ( 2007). Assessing genetic relationships among bitter gourd (Momordica charantia L.) accessions using inter simple sequence repeat (ISSR) markers. Journal of Horticultural and Science and Biotechnology 82: 217-222.
Vejdani M (1997). Importance of safeguarding procedures in  the natural growth and its rolls in Preservation and Operation of Reserve plant inheritance. Proceeding of the 4th Iranian Congress of Crop Science, Esfahan pp 554-573.
Wang JY, Shih JC (2004) Molecular for fingerprinting cultivar of oriental pear (Pyrus pyrifolia Scientia Horticulturae Amsterdam 107: 441-421.
Wünsch A, Hormaza JI (2007). Characterization of variability and genetic similarity of European pear using microsatellite loci developed in apple. Scientia Horticulturae Amsterdam 113: 37-43.
Wünsch A, Hormaza JI (2002). Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers. Euphytica 125: 59-67.
Yamamoto T, Kimura T, Sawamura Y, Ban Y, Aayashi T, Matsuta N (2001). SSRs isolated from apple can identify polymorphism and genetic diversity in pear. Theoretical and Applied Genetics 102: 865-870.
Yamamoto T, Kimura T, Sawamura Y, Manabe T, Kotobuki K, Hayashi T, Ban Y, Mastuta N ( 2002). Simple sequence repeats for genetic analysis in pear. Euphytica, 124: 129-137.
Ye G N, Hemmat M, Lodhi MA, Weeden NF and Reisch BI ( 1996). Long primers for RAPD mapping and fingerprinting of grape and pear. Bio Techniques 20: 368-371.