نوع مقاله : مقاله پژوهشی
چکیده
به منظور بررسی اثر غلظتهای مختلف کیتوزان 0 ، 05/0، 1/0، 2/0، 4/0، 5/0، 1، 2، 3 درصد همراه با تیمار اضافی آب مقطر بر جوانه زنی و رشد گیاهچه گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) تحت تنش کم آبی (0، 4-، 8- و 12- بار) آزمایشی در شرایط محیطی کنترل شده انجام شد. نتایج نشان داد با افزایش تنش، درصد جوانهزنی، شاخص جوانهزنی، طول ساقهچه و ریشهچه، وزن خشک ساقهچه و ریشهچه و محتوی پروتئین کاهش یافت. با تشدید تنش به سطح 8- بار، میزان پرولین، محتوی مالون دی آلدئید، فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز گیاهچهها افزایش یافت. بیشترین طول و وزن خشک ساقهچه در غلظت 4/0 درصد کیتوزان مشاهده شد که نسبت به تیمار آب به ترتیب 3/19 و 36 درصد افزایش نشان دادند. در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان میزان پرولین، پروتئین و فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچهها افزایش یافتند در حالی که محتوی مالون دی آلدئید کاهش نشان داد. در پتانسیل اسمزی 8 - بار، بیشترین درصد جوانه زنی، طول ساقه چه و ریشه چه در غلظت 4/0 درصد کیتوزان به دست آمد. در این پتانسیل اسمزی کاهش میزان پرولین، مالون دی آلدئید، فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز و افزایش پروتئین گیاهچهها در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب مشاهده شد. با افزایش پتانسیل اسمزی در محیط جوانهزنی به 12- بار، درصد جوانه زنی، طول ساقه چه و ریشه چه در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان در مقایسه با تیمار آب افزایش یافتند. همچنین در این سطح تنش کم آبی کمترین مقدار این صفات از غلظتهای 1تا 3 درصد کیتوزان به دست آمد. به این ترتیب میتوان اظهار داشت که پیش تیمار بذر گلرنگ با کیتوزان در غلظتهای 4/0 و پایین تر از آن درصد جوانهزنی را بهبود بخشیده و اثر تنش کم آبی بر پارامترهای جوانهزنی را تعدیل میکند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Effect of chitosan on safflower (Carthamus tinctorius L.) Seed Germination and antioxidant enzymes activity under water stress
چکیده [English]
In order to study the effects of different chitosan concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2, 3%,) along with a additional treatment of distilled water on seed germination of safflower (Carthamus tinctorius L.) seedling, under water stress conditions(0, -4, -8 and -12 bar) an experiment was conducted in a controlled-environment condition. Results showed that germination percentage, germination index, shoot and root height, shoot and root dry weight and protein content decreased with increasing water stress. Proline and malondialdehyde (MDA) content, Catalase (CAT) and peroxidase (POX) activities increased by increasing osmotic potential to -8 bar. The greatest shoot height and dry weight (19.3 and 36% more than distilled water treatment, respectively) were observed at 0.4% chitosan concentration. At low concentrations of chitosan (0.05 - 0.4%) protein and proline contents and CAT activity increased and MDA content decreased. In osmotic potential -8 bar, the highest germination percentage, shoot and root height obtained by 0.4% chitosan concentration. Also at this osmotic potential a decline in and MDA proline contents, CAT and POX activity and an increase in the concentrations of protein (in comparison with distilled water treatment) were detected in low concentrations of chitosan. In the highest level of osmotic potential (-12 bar), germination percentage, shoot and root height increased by low concentrations of chitosan in comparison with distilled water treatment. Also at this osmotic potential the least rate of former parameters obtained by 1-3% chitosan. Thus, it suggests that chitosan concentration at 0.4% or lower levels may improve germination percentage of safflower seeds and benefit for seedlings growth under water deficit stress.
کلیدواژهها [English]
اثر غلظتهای مختلف کیتوزان بر جوانهزنی بذر و آنزیمهای آنتی اکسیدانت گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) در شرایط تنش کم آبی
1 – تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکدة کشاورزی، گروه زراعت
2 – تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکدة علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 16/4/89 تاریخ پذیرش: 1/9/90
چکیده
به منظور بررسی اثر غلظتهای مختلف کیتوزان 0 ، 05/0، 1/0، 2/0، 4/0، 5/0، 1، 2، 3 درصد همراه با تیمار اضافی آب مقطر بر جوانه زنی و رشد گیاهچه گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) تحت تنش کم آبی (0، 4-، 8- و 12- بار) آزمایشی در شرایط محیطی کنترل شده انجام شد. نتایج نشان داد با افزایش تنش، درصد جوانهزنی، شاخص جوانهزنی، طول ساقهچه و ریشهچه، وزن خشک ساقهچه و ریشهچه و محتوی پروتئین کاهش یافت. با تشدید تنش به سطح 8- بار، میزان پرولین، محتوی مالون دی آلدئید، فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز گیاهچهها افزایش یافت. بیشترین طول و وزن خشک ساقهچه در غلظت 4/0 درصد کیتوزان مشاهده شد که نسبت به تیمار آب به ترتیب 3/19 و 36 درصد افزایش نشان دادند. در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان میزان پرولین، پروتئین و فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچهها افزایش یافتند در حالی که محتوی مالون دی آلدئید کاهش نشان داد. در پتانسیل اسمزی 8 - بار، بیشترین درصد جوانه زنی، طول ساقه چه و ریشه چه در غلظت 4/0 درصد کیتوزان به دست آمد. در این پتانسیل اسمزی کاهش میزان پرولین، مالون دی آلدئید، فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز و افزایش پروتئین گیاهچهها در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب مشاهده شد. با افزایش پتانسیل اسمزی در محیط جوانهزنی به 12- بار، درصد جوانه زنی، طول ساقه چه و ریشه چه در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان در مقایسه با تیمار آب افزایش یافتند. همچنین در این سطح تنش کم آبی کمترین مقدار این صفات از غلظتهای 1تا 3 درصد کیتوزان به دست آمد. به این ترتیب میتوان اظهار داشت که پیش تیمار بذر گلرنگ با کیتوزان در غلظتهای 4/0 و پایین تر از آن درصد جوانهزنی را بهبود بخشیده و اثر تنش کم آبی بر پارامترهای جوانهزنی را تعدیل میکند.
واژه های کلیدی: پتانسیل اسمزی، پرولین، فعالیت آنزیمی، کیتوزان، گلرنگ
* نویسنده مسئول، تلفن: 4-44580481-021 ، پست الکترونیکی: modaresa@yahoo.com
مقدمه
خشکی، مهمترین عامل محدود کننده تولید موفقیتآمیز محصولات زراعی در سراسر جهان به حساب میآید، به طوری که تأثیرات زیان باری بر رشد رویشی و زایشی گیاهان دارد (43). به علاوه انتظار میرود تغییرات اقلیمی، اثرات شدیدی روی شدت و فراوانی خشکیها در آینده داشته باشند (17 و 29). کیتین که یکی از فراوان ترین پلیساکاریدهای موجود در طبیعت میباشد، زنجیره پلیمری از N- استیل گلوکوزامین است و با پروتئینها و ترکیبات آلی دیگر همراه میباشد. این ماده، ترکیب اصلی دیوارههای سلولی برخی جانوران از جمله خانواده خرچنگ مانند میگو، خرچنگ و خرچنگ خاردار، حشرات، پاتوژنهای گیاهی و میکروارگانیسمها را تشکیل میدهد. بعد از سلولز، کیتین دومین پلیمر زیستی فراوان موجود در طبیعت است، که کاربردهای متعدد صنعتی، دارویی و کشاورزی برای آن گزارش شده است (3، 32، 33، 48 و54). کیتوزان یک پلیساکارید گلوکوزامین مشتق شده از کیتین است. معمولاً کیتوزان به کیتینی که بیش از 50 درصد گروههای استیل آن حذف شده باشد اطلاق میگردد (31). در کشاورزی از کیتوزان برای پوشش دادن بذر، برگ و میوه (12) استفاده میشود. همچنین بهعنوان کود و در کنترل آزادسازی ترکیبات شیمیایی سموم (41)، برای افزایش تولید گیاه، تحریک ایمنی گیاه (15)، محافظت گیاهان در مقابل میکروارگانیسمها (36) و تحریک جوانهزنی و رشد گیاه به کار میرود.
اثر تحریک کنندگی کیتوزان بر جوانهزنی و رشد گیاهچه های گندم (51)، ذرت (52) و بادام زمینی (53) مشخص شده است. در مطالعات اخیر، اثر مثبت کیتوزان روی رشد ریشهها، ساقهها و برگهای گیاهان مختلف از جمله ژربرا (Gerbera jamesonii) (49) و چند گیاه دیگر مشاهده شده است (9). اثر کیتوزان روی رشد گیاه Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn نیز نشان داده شده است (33). کیتوزان همچنین رشد گیاهان مختلف از قبیل کلم (18)، جوانههای سویا (26) و ریحان (23) را تحریک میکند. لی و همکاران (25) اظهار داشتند که تیمار کیتوزان عملکرد و به طور قابل توجهی رشد جوانههای سویا را افزایش داد. به هرحال مکانیزم عمل کیتوزان روی رشد ناشناخته باقی مانده است. احتمالاً کیتوزان ممکن است سیگنالی را برای سنتز هورمونهای گیاهی مانند جیبرلین القاء کند و رشد و نمو گیاه را توسط بعضی مسیرهای سیگنالینگ مربوط به بیوسنتز اکسین، از طریق مسیر وابسته به تریپتوفان، افزایش دهد (46). تیمار گیاهان برنج با کیتوزان قبل از تنش کم آبی خسارت تنش خشکی در این گیاه را کاهش داده است. این تأثیر به تولید متابولیتهای ثانویه توسط برنج که سبب بسته شدن روزنههای گیاه و کاهش تعرق میشوند نسبت داده شده است (6). گلرنگ به علت توانایی رشد در شرایط تنش آب و ارزش اقتصادی روغن و بذر آن میتواند یک گیاه مناسب در اکوسیسم های زراعی مناطق خشک باشد (21). اگر چه گلرنگ به خشکی مقاوم است، جوانهزنی آن به طور قابل توجهی تحت تأثیر تنش خشکی قرار میگیرد. برای مثال گزارش شده که در گیاهان گلرنگ درصد جوانهزنی، طول ساقهچه و ریشهچه تحت تأثیر تنش آب، کاهش یافت (19). یکی از مهم ترین عوامل مؤثر در حصول عملکرد مطلوب، استقرار مناسب گیاه در مزرعه است که خود وابسته به مرحله جوانهزنی میباشد. این مرحله به شدت از تنشهای محیطی به ویژه تنش کم آبی، تأثیر میپذیرد. با توجه به این موارد و همچنین اهمیت گیاه گلرنگ به عنوان یک دانه روغنی و دارویی، انجام این تحقیق جهت بهبود جوانهزنی آن، ضروری به نظر میرسد.
مواد و روشها
این تحقیق با استفاده از امکانات محیط کنترل شده در آزمایشگاه فیزیولوژی دانشگاه تربیت مدرس بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. عامل اول مقدار کیتوزان در 9 سطح شامل 0، 05/0، 1/0، 2/0، 4/0، 5/0، 1، 2 و 3 درصد کیتوزان (محلول در استیک اسید 1 درصد) همراه با تیمار اضافی آب مقطر (به عنوان شاهد) و عامل دوم تنش کم آبی در 4 سطح (0، 4-، 8- و 12- بار) بود. بدین منظور بذرهای گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) (رقم گلدشت) در غلظتهای مختلف محلولهای کیتوزان و آب مقطر برای 3 ساعت در دمای 25 درجه سانتی گراد غوطهور شد. سطوح مختلف پتانسیل آب مورد نظر برای اعمال تنش کم آبی با استفاده از نمک پلی اتیلن گلایکول 6000 (PEG6000) طبق دستورالعمل میچل و کافمن (30) تهیه گردید. برای تمام تیمارها در هر 3 تکرار 25 عدد از بذرهای تیمار شده با کیتوزان و آب، به پتری دیشهای استریل حاوی کاغذ صافی واتمن شماره 1 انتقال یافت. به هر یک از پتری دیشها 10 میلی لیتر از محلولهای پلی اتیلن گلایکول با سطح مورد نظر اضافه شد و در ژرمیناتور با دمای 20 درجه سانتی گراد گذاشته شد. هشت روز بعد، تعداد بذرهای جوانهزده شمارش، و طول ریشهچه، ساقهچه، وزن خشک ساقهچه و ریشهچه اندازهگیری شد. برای خشک کردن نمونهها، به مدت 48 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. برای سنجش فعالیت آنزیمها، پرولین و تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدی، گیاهچهها در نیتروژن مایع فریز و تا زمان انجام آنالیزهای بیوشیمیایی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
برای اندازهگیری پرولین از روش بیتس (5) استفاده شد. غلظت پرولین نمونهها با استفاده از غلظتهای مشخص پرولین خالص در منحنی استاندارد به عنوان شاهد در طول موج 520 نانومتر بر حسب میلی گرم بر گرم بافت تازه برگ محاسبه گردید. مالون دی آلدئید (MDA) به عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء با روش دوس (11) اندازهگیری شد. میزان MDA نمونهها با اندازهگیری جذب در طول موجهای 532 و 600 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی (ε=155 μM-1cm) محاسبه گردید.
عصارهگیری برای سنجش فعالیت آنزیمی و پروتئین: 2/0 گرم از بافت گیاهی تازه منجمد شده در نیتروژن مایع در بافر پتاسیم فسفات 05/0 مولار، 8/6 pH= در دمای 4-0 درجه سانتیگراد ساییده و عصارهگیری شد و سپس همگنای حاصل در 12000 دور در دقیقه در دمای 4-2 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمها و پروتئینها مورد استفاده قرار گرفت.
سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز بر طبق روش پاندولفینی و همکاران (34) انجام شد. در این روش از بافر پتاسیم فسفات 05/0 مولار در حضور گایاکول با غلظت نهایی 28 میلی مولار و پراکسید هیدروژن با غلظت نهایی 5 میلی مولار استفاده شد. فعالیت آنزیمی به ازای تغییرات جذب در طول موج 470 نانومتر به میلیگرم پروتئین در دقیقه بیان شد.
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز : سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز به روش ککمک و هورست (8) انجام شد. مخلوط واکنش شامل عصارة آنزیمی، بافر و پراکسید هیدروژن با غلظت نهایی 10 میلی مولار بود. تجزیه آب اکسیژنه با کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر پیگیری و به ازای هر میلیگرم پروتئین در عصارة آنزیمی بیان شد.
پروتئین: میزان پروتئین گیاهچهها نیز طبق روش برادفورد (7) تعیین شد. بدین منظور 1 میلی لیتر از محلول برادفورد به همراه 100 میکرولیتر عصارة آنزیمی پس از گذشت 10 تا 15 دقیقه، در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار گرفت و جذب محلول در طول موج 595 نانومتر ثبت شد. غلظت پروتئین بر حسب میلیگرم بر گرم بافت تازه با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد.
از نرم افزار SAS برای تجزیه آماری دادهها استفاده و با مشاهده تفاوت معنیدار در آنالیز واریانس (ANOVA) مقایسه میانگینها با آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال (05/0P<) صورت گرفت.
نتایج
تجزیة واریانس دادهها (جدول 1) نشان داد که تنش کم آبی بر کلیه صفات مورد ارزیابی تأثیر گذاشته است (01/0P<) همچنین پرایمینگ بذر گلرنگ با کیتوزان سبب ایجاد تفاوت معنیدار در پارامترهای جوانهزنی شد. به طوری که با افزایش سطح تنش کم آبی، درصد جوانهزنی به طور معنیداری کاهش یافت یعنی از 1/83 درصد در تیمار بدون تنش به 1/41 درصد در تنش کم آبی با پتانسیل آب 12- بار رسید. آغشتن بذرها با کیتوزان 4/0 درصد کیتوزان در مقایسه با دو تیمار آب و استیک اسید تفاوت معنیداری ایجاد نکرد، اما از سطح 5/0 به بعد کاهش معنیداری مشاهده گردید (جدول 2). در شرایط بدون تنش هر دو تیمار از نظر درصد جوانهزنی با سطوح مختلف کیتوزان تفاوت معنیداری نداشتند. در تنش 4- بار بیشترین درصد جوانهزنی در تیمار آب مشاهده شد که تفاوت معنیداری با تیمار استیک اسید و غلظتهای مختلف کیتوزان، غیر از 2/0 و 3 درصد نداشت. بیشترین درصد جوانهزنی در تنش 8- بار در غلظت کیتوزان 4/0 درصد و کمترین آن در غلظت 2 درصد کیتوزان مشاهده شد. در تنش 12- بار درصد جوانهزنی در غلظتهای 4/0 و 05/0 درصد کیتوزان بیشترین و در غلظت 1 درصد کمترین بود. در این سطح تنش، تیمار بذرها با غلظتهای 05/0 تا 5/0درصد کیتوزان درصد جوانهزنی را بیشتر از تیمار آب افزایش دادند در حالی که تفاوت معنیداری با تیمار استیک اسید نداشتند. همچنین درصد جوانهزنی در غلظتهای 1تا 3 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب و استیک اسید کاهش یافت (جدول 3). مقایسه میانگین صفات نشان داد که شاخص جوانهزنی در پتانسیل اسمزی 12- بار کمترین مقدار بود که از نظر آماری با بقیه سطوح اختلاف معنیداری داشت. در غلظت کیتوزان 05/0 بیشترین شاخص جوانهزنی مشاهده شد. سطوح کیتوزان 05/0 تا 4/0درصد اختلاف معنیداری با تیمار آب مقطر نداشتند اما از سطح 5/0 درصد به بعد کاهش معنیداری مشاهده شد. شاخص جوانهزنی در سطح کیتوزان 05/0 درصد نسبت به تیمار استیک اسید بیشتر و از سطح 1/0 تا 5/0 اختلاف معنی داری با تیمار استیک اسید نداشت. در سطوح کیتوزان 1 و 3 شاخص جوانهزنی نسبت به تیمار استیک اسید کاهش یافت (جدول 2).
در شرایط بدون تنش، تیمار آب مقطر بیشترین و تیمار استیک اسید، غلظت 1/0، 4/0 و 1 کیتوزان کمترین شاخص جوانهزنی را داشتند. در تنش 4- بار بیشترین شاخص جوانهزنی در تیمار آب مقطر و غلظت 1/0 کیتوزان و کمترین آن در غلظت 3 بار کیتوزان مشاهده شد. شاخص جوانهزنی در تنش 8- بار در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد اختلاف معنیداری با تیمار آب مقطر و استیک اسید نداشت اما از غلظت 5/0 درصد به بعد کاهش معنی داری در این صفت مشاهده شد. شاخص جوانهزنی در تنش 12- بار در غلظت 05/0 تا 4/0 درصد بیشتر از تیمار آب مقطر و استیک اسید بود بنابراین با افزایش تنش به 12- بار این صفت در غلظتهای پایین کیتوزان نسبت به تیمار آب مقطر و استیک اسید افزایش یافت (جدول 3).
طول ساقهچه با افزایش سطوح تنش به طور معنیداری کاهش یافت. تنش کم آبی 12- بار نسبت به تیمار آب طول ساقهچه را 6/95 درصد کاهش داد. طول ساقهچه در سطح کیتوزان 4/0 درصد حداکثر بود که نسبت به تیمار آب افزایش نشان داد. حداقل طول ساقهچه در سطح کیتوزان 3 درصد به دست آمد (جدول 2). در شرایط بدون تنش، این صفت در سطوح مختلف کیتوزان با تیمار آب و اسید استیک اختلاف معنیداری نداشت. تحت تنش 4- بار، طول ساقهچه در سطح کیتوزان 3 درصد نسبت به تیمار آب و اسید استیک کاهش یافت در حالیکه این صفت در سطوح دیگر کیتوزان اختلاف معنیداری با این دو تیمار نداشت. طول ساقهچه در شرایط تنش 8- بار، در سطح کیتوزان 2 و 3 درصد نسبت به تیمار آب و اسید استیک کاهش یافت و در سطوح دیگر کیتوزان اختلاف معنیداری با این دو تیمار نداشت. در شرایط تنش 12- بار، بیشترین طول ساقهچه در سطوح کیتوزان 05/0 و 4/0 درصد مشاهده شد در حالیکه تیمارهای آب و استیک اسید و بقیه سطوح کیتوزان غیر از 1/0 و 2/0 ساقهچهای تولید نکردند (جدول 3).
مقایسه میانگین طول ریشهچه در سطوح پتانسیل اسمزی حاکی از آن بود که بیشترین طول ریشهچه در تیمار شاهد (صفر بار) به دست آمد و با افزایش پتانسیل اسمزی طول ریشهچه کاهش یافت. طول ریشهچه در سطوح کیتوزان 05/0 تا 4/0 درصد نسبت به تیمار آب و استیک اسید افزایش یافت درحالی که از سطح 5/0 درصد به بعد کاهش یافت (جدول 2). در شرایط بدون تنش، طول ریشهچه در غلظتهای مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب و استیک اسید نداشتند. وقتی گیاهچهها در معرض تنش 4- بار قرار گرفتند، طول ریشهچه در سطح کیتوزان 2/0 درصد بیشترین مقدار داشت و کمترین مقدار آن مربوط به تیمار استیک اسید بود که با سطوح 5/0 تا 3 درصد کیتوزان اختلاف معنیداری نداشت. طول ریشهچه در شرایط تنش 8- بار در سطح کیتوزان 4/0 درصد بیشترین و 2 و3 درصد کمترین بود. در سطح تنش 12- بار، بیشترین طول ریشهچه در سطح کیتوزان 05/0 درصد مشاهده شد که با سطوح 1/0 تا 5/0 اختلاف معنیداری نداشت. در این سطح تنش، در سطوح 1 و 2 درصد کیتوزان، هیچ ریشه چهای تولید نشد (جدول 3).
مقایسه میانگین صفات بررسی شده نشان داد که وزن خشک ساقهچه در پتانسیل اسمزی صفر و 4- بار بیشترین بود و با افزایش پتانسیل اسمزی از 4- بار مقدار آن کاهش مییابد به طوری که در 12- بار حداقل وزن خشک ساقه چه مشاهده شد. بیشترین وزن خشک ساقهچه در سطح کیتوزان 4/0 درصد مشاهده شد که با تیمار آب و اسید استیک اختلاف معنیداری داشت (جدول 2). در شرایط بدون تنش، وزن خشک ساقهچه در مقادیر مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب نداشت. در این شرایط حداقل وزن خشک ساقهچه در تیمار اسید استیک مشاهده شد. در پتانسیل اسمزی 4- و 8- بار، وزن خشک ساقهچه در مقادیر مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب و اسید استیک نداشت. بیشترین وزن خشک ساقهچه در شرایط تنش 12- بار، در سطوح کیتوزان 4/0 درصد مشاهده شد که اختلاف معنیداری با سطوح کیتوزان 05/0 و 1/0 درصد نداشت. در حالیکه در تیمارهای آب و استیک اسید و سطوح کیتوزان 5/0 به بالا ساقهچهای تولید نشد (جدول 3).
وزن خشک ریشهچه در پتانسیل اسمزی صفر اختلاف معنیداری با 4- بار نداد و با افزایش پتانسیل اسمزی از 4- بار وزن خشک ریشهچه کاهش یافت. وزن خشک ریشهچه در مقادیر مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب و اسید استیک نداشت (جدول 2). وزن خشک ریشه چه در پتانسیل اسمزی صفر، در مقادیر مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب نداشت. در این شرایط حداقل وزن خشک ریشهچه در تیمار اسید استیک مشاهده شد. در پتانسیل اسمزی 4- و 8- بار، وزن خشک ریشهچه در مقادیر مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب و اسید استیک نداشت. در شرایط تنش 12- بار، بیشترین وزن خشک ریشه چه، در سطوح کیتوزان 05/0 درصد مشاهده شد که اختلاف معنیداری با سطوح کیتوزان 4/0، 1/0 درصد و تیمار استیک اسید نداشت (جدول 3).
با افزایش تنش کم آبی به 8- بار، میزان پرولین افزایش یافت. بیشترین میزان پرولین در غلظت کیتوزان 2/0 درصد مشاهده شد که نسبت به تیمار آب و استیک اسید افزایش یافت. میزان این صفت در غلظتهای 4/0 تا 3 درصد کیتوزان با تیمار آب اختلاف معنیداری نداشت (جدول 2). در شرایط بدون تنش بیشترین میزان پرولین در غلظت کیتوزان 2/0 درصد مشاهده گردید. در این شرایط میزان پرولین در غلظتهای 1 تا 3 درصد کیتوزان یکسان و با تیمار آب و استیک اسید اختلاف معنیداری نداشت. در پتانسیل اسمزی 4- بار، میزان پرولین در غلظتهای 1/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب اختلاف معنی داری نداشت در حالی که در غلظتهای 5/0 تا 3 درصد کیتوزان افزایش یافت. کمترین میزان این صفت در غلظت کیتوزان 05/0 درصد مشاهده گردید که نسبت به تیمار آب 31/42 درصد کاهش نشان داد. میزان پرولین در گیاهچههای تحت پتانسیل اسمزی 8- بار در غلظتهای 1 تا 2 درصد کیتوزان افزایش یافت که نسبت به تیمار آب اختلاف معنیداری نداشت. اما در غلظتهای 05/0 تا 5/0 درصد کیتوزان این صفت کاهش یافت. پیش تیمار بذر با کیتوزان 1/0 درصد در پتانسیل اسمزی 12- بار سبب کاهش اثر مضر تنش شده و پرولین گیاهچهها را کاهش داد (جدول 3).
محتوی مالون دی آلدئید (MDA) گیاهچهها با افزایش تنش کم آبی به 8- بار، افزایش یافت. بیشترین محتوی MDA در غلظت کیتوزان 3 درصد به دست آمد و کمترین مقدار آن مربوط به کیتوزان 2/0 درصد بود (جدول 2). در شرایط بدون تنش، تیمار آب بیشترین محتوی MDA را به خود اختصاص داد. در این شرایط کمترین محتوی MDA مربوط به غلظت کیتوزان 1/0 درصد بود که با کیتوزان 05/0 و 4/0 درصد اختلاف معنی داری نداشت. خیساندن بذر در محلول 5/0 تا 3 درصد کیتوزان، سبب افزایش معنیداری در پراکسیداسیون لیپیدی غشاء (نسبت به تیمار آب) در پتانسیلهای اسمزی 4- بار میشود. در پتانسیلهای اسمزی 4- و 8- بار کاهش محتوی MDA گیاهچه ها در غلظتهای 05/0 تا 2/0 درصد کیتوزان مشاهده شد. در پتانسیل اسمزی 12- بار، غلظت کیتوزان 1/0 درصد سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدی شد که اختلاف معنیداری با غلظت کیتوزان 05/0 درصد نداشت (جدول 3).
با افزایش تنش کم آبی غلظت پروتئین گیاهچههای گلرنگ کاهش یافت. افزایش غلظت کیتوزان از 05/0 تا 5/0 درصد سبب افزایش غلظت پروتئین در مقایسه با تیمار آب و استیک اسید (0 درصد) گردید (جدول 2). در گیاهچههای تنش ندیده تغییری در مقدار پروتئین در غلظتهای 05/0 تا 1 درصد کیتوزان در مقایسه با تیمار آب مشاهده نشد در حالی که این صفت در غلظتهای 2 و 3 درصد کیتوزان کاهش یافت. پیش تیمار بذر با محلول 05/0 تا 3 درصد کیتوزان در پتانسیل اسمزی 4- بار سبب افزایش غلظت پروتئین نسبت به تیمار آب شد. در پتانسیل اسمزی 8- بار، مقدار این صفت در غلظتهای 05/0 تا 5/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب افزایش یافت و همچنین در غلظتهای 1 و 3 درصد کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب نداشت. مقدار پروتئین در پتانسیل اسمزی 12- بار، در غلظت 1/0 درصد کیتوزان بیشترین مقدار بود (جدول 3).
با افزایش تنش کم آبی به 8- بار، میزان فعالیت آنزیم کاتالاز افزایش یافت. کیتوزان در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد در مقایسه با تیمار آب و استیک اسید سبب افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شد (جدول 2). در شرایط بدون تنش، فعالیت این آنزیم در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب افزایش و در غلظتهای 1 تا 3 درصد کاهش یافت. در پتانسیل اسمزی 4- بار، فعالیت آنزیم کاتالاز گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب و استیک اسید نداشت. بذرهای تیمار شده با غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان زمانی که در پتانسیل اسمزی 8- بار قرار گرفتند میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در آنها نسبت به تیمار آب کاهش یافت. در پتانسیل اسمزی 12- بار، غلظت 4/0 درصد کیتوزان فعالیت این آنزیم را تحریک نمود (جدول 3).
میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز با افزایش تنش کم آبی به 8- بار افزایش یافت. پیش تیمار بذرها با غلظتهای مختلف کیتوزان تأثیری بر فعالیت آنزیم پراکسیداز نداشت (جدول 2). در شرایط بدون تنش، فعالیت این آنزیم در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب افزایش و در غلظتهای 5/0 تا 3 درصد کاهش یافت. در پتانسیل اسمزی 4- بار، فعالیت آنزیم پراکسیداز در غلظتهای مختلف کیتوزان و تیمار آب یکسان بود. بذرهای تیمار شده با غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان زمانی که در پتانسیل اسمزی 8- بار قرار گرفتند میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در آنها نسبت به تیمار آب کاهش یافت. در پتانسیل اسمزی 12- بار، غلظت 05/0 درصد کیتوزان فعالیت این آنزیم را تحریک نمود (جدول 3).
بحث
با توجه به نتایج به دست آمده مشخص شد که درصد و شاخص جوانهزنی، طول ساقهچه و ریشهچه، وزن خشک ساقهچه و ریشهچه بذرها به طور معنیداری در اثر تنش کم آبی کاهش مییابند. نتایج مشابهی نیز توسط سید شریفی و سید شریفی (1387) گزارش شده است (2). درصد و شاخص جوانهزنی بذرهای گلرنگ در غلظتهای پایین کیتوزان (05/0 تا 4/0 درصد) نسبت به تیمار آب تغییری نشان ندادند در حالی که در این شرایط افزایش طول ساقهچه، طول ریشهچه و وزن خشک ساقهچه مشاهده شد. در غلظتهای بالای کیتوزان (1 تا 3 درصد)، این صفات نسبت به تیمار آب افزایش یافتند. گان و همکاران (14) نشان دادند که کیتوزان اثر معنیداری بر جوانهزنی بذرهای ذرت در دمای پایین نداشت، در حالی که شاخص جوانهزنی، طول ساقهچه، طول ریشهچه و وزن خشک ساقهچه و ریشهچه را در دو دودمان ذرت آزمایش شده، افزایش داد. به طور مشابه در بذرهای بادام زمینی خیسانده شده در کیتوزان، افزایش سرعت و انرژی جوانه زنی مشاهده شده است (58). کیتوزان در غلظتهای پایین میتواند جوانهزنی بذرهای سویا را افزایش دهد در حالی که غلظتهای بالای آن ممکن است برای بذر سمی باشند (22).
به نظر میرسد با افزایش پتانسیل اسمزی (12- بار) درصد و شاخص جوانهزنی گیاهچهها، طول ریشهچه و وزن خشک ریشهچه در غلظتهای 05/0 تا 5/0درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب بیشتر و در غلظتهای 1تا 3 درصد کمتر بودند. در این شرایط، گیاهچهها در غلظتهای 5/0 تا 3 درصد هیچ ساقهچهای تولید نکردند. بنابراین میتوان نتیجه گرفت کیتوزان در غلظتهای پایین تر از 5/0 میتواند کاهش درصد و شاخص جوانهزنی ناشی از افزایش تنش کم آبی را جبران کند. بنا به اظهار نظر محققین، پوشش بذر با کیتوزان ممکن است جوانهزنی بذر را افزایش داده و تحمل به شرایط تنش را در گیاهچههای برنج افزایش دهد (37). مشخص شده است که غلظتهای بالای کیتوزان به علت پوشش چسبندهای که روی قسمت بیرونی بذر گیاهان ایجاد میکند، ممکن است سبب جلوگیری از جذب آب توسط بذر شود (4).
تحت تیمار خشکی میزان پرولین گیاهچهها افزایش می یابد. تجمع ترکیبات آلی مانند پرولین در سیتوپلاسم نقش مهمی را در کاهش تنش اسمزی ایفاء میکنند (50). افزایش تجمع پرولین در حین تنش می تواند به دلیل تحریک سنتز آن از اسید گلوتامیک، کاهش صادرات آن از طریق آوند آبکشی، جلوگیری از اکسیداسیون آن در طول تنش و تخریب و اختلال در گیاهان در طول تنشهای رطوبتی، برای انجام فرآیند سنتز پروتئینها باشد (28). میزان پرولین در غلظتهای 05/0 تا 2/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب افزایش یافت. در این بررسی مشاهده شد که کیتوزان در غلظتهای پایین (05/0 تا 4/0 درصد) باعث کاهش میزان پرولین با افزایش پتانسیل اسمزی میشود در حالی که با افزایش غلظت کیتوزان، میزان پرولین افزایش مییابد. تجمع MDA اغلب به عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی استفاده شده است (39). در این مطالعه محتوی MDA با افزایش تنش کم آبی به 8- بار، افزایش یافت. تنش کم آبی باعث افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) میشود که مسئول اکسیداسیون لیپیدهای غشاء میباشد (45). در تحقیق حاضر محتوی MDA در غلظتهای پایین کیتوزان کاهش یافت. پرایمینگ بذرهای ذرت با کیتوزان نیز منجر به کاهش محتوی MDA شده است (14). همچنین در گیاه آبزی Hydrilla verticillat مشخص شده که محتوی MDA در گیاهان تیمار شده با کیتوزان نسبت به شاهد کاهش مییابد (56). به نظر میرسد کیتوزان میتواند با کلاته کردن یونهای فلزی یا ترکیب شدن با لیپیدها، اکسیداسیون لیپیدها را کاهش دهد (57). در این آزمایش با افزایش پتانسیل اسمزی محتوی MDA گیاهچهها در غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان نسبت به تیمار آب کاهش یافت. به نظر میرسد کیتوزان در غلظتهای پایین، با از بین بردن رادیکالهای آزاد بطور مستقیم و یا توسط آنزیمهای آنتی اکسیدان، از اکسیداسیون چربیها جلوگیری نموده و مانع افزایش مالون دی آلدهید شود.
طبق نتایج به دست آمده تنش کم آبی غلظت پروتئین را کاهش میدهد درحالی که پیش تیمار بذرها با غلظتهای پایین کیتوزان (05/0 تا 5/0 درصد) سبب افزایش آن گردید. تحت شرایط تنش شدید کاهش معنى دار پروتئین در گیاهچهها را مىتوان هم به تخریب پروتئین و هم کاهش سنتز آن (20) نسبت داد. وقتی گیاهچهها در معرض تنش بالا (8-) و غلظتهای پایین کیتوزان قرار میگیرند غلظت پروتئین در آنها افزایش مییابد. در شرایط تنش آب، اکسیژن فعال در گیاهان تجمع مییابد. در این شرایط در گیاهان یک سیستم دفاعی ایجاد میشود که توسط آنزیمهای محافظت کننده درونی تسریع میشود که به خوبی از صدمات اکسیژن فعال جلوگیری میکند و بنابراین به فعالیت عادی گیاه کمک میکنند (47). زمانی که گیاهان در معرض تنش کم آبی قرار میگیرند، لازم است که تمام سیستمهای دفاعی برای مقابله با صدمات اکسیژن فعال، فعالیت خود را شروع کنند. در بسیاری از گیاهان مشخص شده که تنش خشکی فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسیداز را تحت تأثیر قرار میدهد (20). مطالعات زیادی نشان داده است که درجه خسارت ایجاد شده توسط تنش خشکی همبستگی منفی با افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسیداز دارد (10، 13). در این تحقیق نیز با کاهش پتانسیل آب به 8- بار میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز افزایش یافت. افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسیداز در واکنش به تنش کم آبی توسط سایر محققین نیز گزارش شده است (1، 24، 40). به نظر می رسد در گیاهچههای گلرنگ آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز نقش کلیدی در محافظت گیاهچهها در برابر تنش کم آبی دارند. پیش تیمار بذرها با غلظتهای 05/0 تا 4/0 درصد کیتوزان سبب افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز گردید. پیش تیمار بذرها با غلظتهای مختلف کیتوزان تأثیری بر فعالیت آنزیم پراکسیداز نداشت. در دو لاین ذرت آزمایش شده، کیتوزان منجر به افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز شد (14). در شرایط تنش خشکی، بافتهای گیاه از طریق افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت اثرات زیان بار رادیکالهای آزاد (ROS) را کاهش میدهد (38). بنابراین این واکنشها موجب سازگاری کوتاه مدت به کم آبی می شوند، اما فعالیتهای آنزیمی و آنتیاکسیدانتها نمیتوانند روی خشکی شدید و دراز مدت مؤثر باشد (44).
اخیراً فعالیت آنتیاکسیدانت کیتوزان مورد توجه زیادی قرار گرفته است (35). کیتوزان میتواند رادیکالهای آزاد OH و O2 را خنثی کند و مشخص شده که خاصیت حفاظت کننده از DNA را دارد (16). مکانیسم خنثی کنندگی رادیکالهای آزاد کیتوزان ممکن است به ساختار خاص آن مربوط باشد که از تعداد زیادی گروه آمین و هیدروکسیل قابل دسترس تشکیل شده که با رادیکالهای آزاد (ROS) واکنش نشان میدهد (27، 42، 55). در این آزمایش، اعمال سطح تنش 8- بار همراه با خیساندن بذر در غلظتهای پایین کیتوزان منجر به کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز شد. این کاهش فعالیت این آنزیمها در گیاهچههای تنش دیده را میتوان به اثر آنتی اکسیدانی کیتوزان در خنثی سازی مستقیم یون سوپر اکسید نسبت داد .همچنین نتایج نشان داد که فعالیت این آنزیمها در غلظتهای 5/0 تا 3 درصد کیتوزان اختلاف معنیداری با تیمار آب نداشت.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که پیش تیمار بذرهای گلرنگ با غلظتهای پایین کیتوزان (05/0 تا 4/0 درصد) اثر مثبتی بر جوانهزنی داشته و با تأثیر بر سیستم دفاع آنتی اکسیدانی گیاه سبب افزایش مقاومت گیاهچههای گلرنگ تحت تنش کم آبی میگردد.
1- دولت آبادیان، آ.، مدرس ثانوی س. ع. م و شریفی م. 1388. اثر تنش کم آبی و محلول پاشی اسید اسکوربیک بر میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و برخی تغییرات بیوشیمیایی در برگ ذرت دانهای (Zea maize L.). مجله زیست شناسی ایران، جلد 22، شماره 2 : 422-407.
2- سید شریفی، ر و ر. سید شریفی. 1387. بررسی اثراتPEG بر جوانه زنی و رشد گیاهچه ارقام گلرنگ. مجله زیست شناسی ایران، جلد 21، شماره 3 : 410-400.