نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد گیاهان دارویی
2 هیات علمی دانشگاه ارومیه
3 استادیار دانشگاه ارومیه
چکیده
زرین گیاه با نام علمی (Dracocephalum kotschyi Boiss) گیاهی علفی، چندساله و اندمیک ایران از خانواده نعناع است. تحقیقات اخیر دارویی نشان داده است که فلاونوئید متوکسی موجود در قسمتهای مختلف گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. ریشههای مویین پس از تلقیح ریزنمونه برگی با سویه 15834 باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز بدست آمد. در این مطالعه اثر محرکهای زیستی شامل محرک کلشیسین در غلظتهای (0، 01/0، 03/0 و 05/0 درصد) و کیتوسان در غلظتهای (0، 50، 100 و 150 میلیگرم در لیتر) به مدت 48 ساعت بر رشد ریشههای مویین تولید شده و تولید رزمارینیک اسید مطالعه شد. آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کلشیسین و کیتوسان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل، فنل کل و میزان فلاونوئید نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (P 0.01) قابل مشاهده میباشد. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد میباشد (33/90 درصد) و کم ترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشههای غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد میباشد (33/90 درصد). نتایج آنالیز HPLC نشان داد که بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشههای تراریخت تیمار شده با محرک کلشیسین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوسان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 و کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشههای غیر تراریخت (شاهد)، µg /mg DW 8/13 و ثبت گردید.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
induction Effects of Colchicine and Chitosan on Rosmarinic Acid Production in Hairy Root Cultures of Zarrin-Giah (Dracocephalum kotschyi Boiss
نویسندگان [English]
1
2
3
چکیده [English]
Dracocephalum kotschyi Boiss belonging to Labiateae family is an herbaceous, pereninal and endemic plant known in Iran as Zarrin-Giah. Recent pharmacological studies demonstrated this plants with methoxylated flavonoids, have anti-cancer effects. Hairy roots were obtained from leaves explants, inoculated with 15834 strain of Agrobacterium rhizogenesis. In present study, The effects of biotic elicitors including, Colchicine with different cocentrations ( 0, 0.01, 0.03 and 0.05% (w/v)) and Chitosan (0, 50, 100 and 150 mg/l) for 48 hours on hairy root growth and Rosmarinic acid production were investigated. ANOVA results of Antioxidant activity, total phenol and total flavonoids showed significant difference among the various treatments (P<0.01). maximum Antioxidant activity (90.23%) was observed in 0.05% colchicine and lowest Antioxidant activity (63%) was observed in non-transformed roots. HPLC analysis revealed that the maximum Rosmarinic acid content (35.8 and 15.1 µg /mg DW ) obtained in colchicine (0.05%) and chitosan (100 mg/l) respectively. Although minimum Rosmarinic acid content (13.8 µg /mg DW) were recorded in non-transformed roots. based on the importance of rosmarinic acid production in the pharmaceutical industry, the results showed that using biotechnological methods, production improving of valuable medicinal substances is acceptable.
کلیدواژهها [English]
اثر القایی کیتوزان و کلشیسین بر تولید رزمارینیک اسید در ریشه مویین زرین گیاه (Dracocephalum kotschyi Boiss)
نسرین ایوبی، بهمن حسینی* و محمد فتاحی
ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
تاریخ دریافت: 19/10/94 تاریخ پذیرش: 27/2/95
چکیده
زرین گیاه با نام علمی (Dracocephalum kotschyi Boiss) گیاهی علفی، چندساله و اندمیک ایران از خانواده نعناع است. تحقیقات اخیر دارویی نشان داده است که فلاونوئید متوکسی موجود در پیکره رویشی گیاه خاصیت ضدسرطانی دارد. ریشههای مویین پس از تلقیح ریزنمونه برگی با سویه 15834 باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز به دست آمد. در این مطالعه اثر محرکهای زیستی شامل محرک کلشیسین در غلظتهای (0، 01/0، 03/0 و 05/0 درصد) و کیتوزان در غلظتهای (0، 50، 100 و 150 میلیگرم در لیتر) به مدت 48 ساعت بر رشد ریشههای مویین تولید شده و تولید رزمارینیک اسید مطالعه شد. آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کلشیسین و کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی کل، فنول کل و میزان فلاونوئید نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار وجود دارد. بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان (33/90 درصد) مربوط به سطح 05/0 درصد کلشیسین می باشد و کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشههای غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید. نتایج آنالیز HPLC نشان داد که بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشههای تراریخت تیمار شده با محرک کلشیسین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوزان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 و کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشههای غیر تراریخت (شاهد)، µg /mg DW 8/13 و ثبت گردید. با توجه به اهمیت تولید رزمارینیک اسید در صنعت داروسازی، نتایج مطالعه نشان داد که با استفاده از روشهای فنآوری زیستی امکان بهبود تولید ترکیبات ارزشمند دارویی فراهم می باشد. 0441-32779558
واژه های کلیدی: آگروباکتریوم رایزوژنز، رزمارینیک اسید، ریشه مویین، محرک
* نویسنده مسئول، تلفن: 32779558-0441 ، پست الکترونیکی: b.hosseini@urmia.ac.ir
مقدمه
جنس Dracocephalum از مهمترینجنسهایتیرهنعناع بوده که شامل 186 گونه می باشد که 8 گونه آن در ایران میروید. یکی از گونههای مهم بومی این جنس در ایرانDracocephalum kotschyi Boiss است که در قسمتهایی از شمال، غرب و مرکز ایران یافت میشود (28). این گونه انحصاری با نام زرین گیاه (20=n2) و بادرنجبویه دنایی مشخص میشود. زرین گیاه یکی از گیاهان در معرض انقراض ایران می باشد (5).
تحقیقات اخیر نشان داده است که ترکیبات موجود در زرین
گیاه از لحاظ دارویی ارزشمند بوده و حاوی اسانس، فلاونوئید، رزمارینیک اسید و گلیکوزیدهای مونوترپن می باشد. پیکره رویشی زرین گیاه حاوی اسانس بوده و درصد آن بین 6/0 تا 67/1 (حجمی به وزنی) گزارش شده است (3). رزمارینیک اسید دارای فعالیتهای زیستی قابل توجهی از جمله: ضد ویروس، ضد باکتری، ضد فسادپذیری و آنتیاکسیدانی است (37).
با توجه به اینکه امروزه روشهای قدیمی و کلاسیک تکثیر و اصلاح گیاهان به تنهایی جوابگوی بسیاری از نیازها نمی باشد، لازم است روشهای جدیدتری جایگزین یا تکمیل کننده روشهای قبلی مورد استفاده قرار گیرد. مناسبترین راه برای رسیدن به این هدف، استفاده از روشهای زیست فناوری می باشد (4). سیستم آگروباکتریوم، اولین سیستم تراریختی موفق در گیاهان میباشد که کاربرد آن در سال 1983 میلادی، علائمی از برطرف شدن موانع در مهندسی ژنتیک گیاهی می باشد (10). القاء ریشه موئین به پارامترهای مختلفی وابسته است مثل: گونه گیاهی، سن و بافت گیاهی. عموماً نمونههای جوان به باکتریها خیلی حساس هستند (31). مطالعات قبلی روی القای ریشه مویین از ریز نمونههای برگی و گیاهچههای یک ماهه Dracocephalum kotschyi توسط سویه های مختلف آگروباکتریوم رایزوژنز (LBA 9402 ،A13 ،ATTCC15834 ،A4 و MSU 440) نشان داد که بالاترین درصد تراریختی (60 درصد) از سویه ATTCC 15834 حاصل گردید (2).
افزایش تولید متابولیتهای ثانویه، از طریق محرکها در کشت سلولی گیاه، فضای مطالعاتی جدیدی باز کرده است که میتواند منافع اقتصادی مهم برای صنایع زیستی داشته باشد که بسیاری از این ترکیبات از ارزش بالای دارویی برخوردارند (7 و 20). کیتوزان پلی ساکاریدی است که به فراوانی در طبیعت از صدف و سایر سخت پوستان دریایی از جمله
Pandalus borealisو دیواره سلولی قارچها بهدست میآید (17). در ریحان کیتوزان موجب افزایش مقدار ترکیبات فنولی کل و ترپندار، بهویژه اسید رزمارینیک و اوژنول میشود (21). در تحقیقی اثر کیتوزان 150 میلی گرم در لیتر روی ریشه مویین Artemisinin annua L. صورت گرفت، و باعث افزایش آرتمیزینین به مقدارµg /mg 8/1 شد (26). کلشیسین آلکالوئیدی است که برای اولین بار از غدة گل حسرت(Colchicum autumnale) پاییزه توسط Zeisel در سال1883 استخراج شد (6). با توجه به اهمیت زرین گیاه و ترکیبات بسیار با ارزش این گیاه که کاربرد بسیار فراوانی در داروسازی دارد و با توجه به قرار گرفتن گیاه در لیست گیاهان در معرض انقراض برای استفاده از این گیاه در کوتاه مدت، روشهای کشت بافت شامل کشت سلول و سیستم ریشه مویین می تواند با مقدار کم مواد اولیه انجام شود. بنابراین در پژوهش حاضر برای اولین بار اثر برخی از محرکها مانند کلشی سین و کیتوزان بر میزان مواد مؤثره در این گیاه مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی: تمامی آزمایشات این پژوهش در قالب طرح کاملاً تصادفی، در آزمایشگاه کشت بافت گیاهی گروه علوم باغبانی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه انجام گردید. همچنین مطالعات ژنتیکی و تأیید حضور ژن rol B نیز در پژوهشکده زیست فنآوری دانشگاه ارومیه انجام گردید. برای انجام کار ابتدا بذرهای زرین گیاه، از شرکت پاکان بذر (اصفهان-ایران) خریداری شد. بهمنظور برطرف کردن خواب بذر، ابتدا بذور در اسید سولفوریک غلیظ به مدت 10 دقیقه غوطهور شدند تا حداکثر جوانهزنی بذور اتفاق افتد (13). جهت ضدعفونی، بذور ابتدا در اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه غوطهور شده و سپس 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده و بعد با هیپوکلریت سدیم 10 درصد تجاری به مدت 10 دقیقه ضدعفونی و در نهایت 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. لازم به ذکر می باشد که تمام این مراحل در زیر هود لامینار انجام گردید.
القای ریشه مویین: در این آزمایش ریزنمونههای تهیه شده از برگهای یک هفتهای با سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز )3/0-4/0= (OD به مدت 1 دقیقه به روش غوطهوری تلقیح داده شد و سپس به محیط کشتMS انتقال داده شدند و در دمای 28 درجه سانتی گراد و به مدت 48 ساعت در شرایط تاریکی در دمای 2±24 جهت القای ریشه مویین نگهداری شدند و بعد از 48 ساعت نمونهها 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده و به روی کاغذ صافی استریل شده جهت جذب آب اضافی انتقال داده شدند. سپس نمونهها به محیط کشتMS حاوی 200 میلیگرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم جهت حذف باکتری از ریزنمونه منتقل شده و جهت ظهور ریشههای مویین در شرایط تاریکی و در زیر فویل آلومینیومی نگهداری شدند. 1/0 گرم از لاین پر رشد ریشههای مویین به شیشههای مخصوص توریدار که حاوی 30 میلیلیتر محیط مایع MS 4/1 بودند در زیر هود لامینار انتقال داده شد و پس از یک هفته شروع به اعمال تیمار اول کیتوزان در 3 غلظت 50، 100 و 150 میلیگرم در لیتر در 3 تکرار و تیمار دوم کلشیسین در 3 غلظت 01/0، 03/0 و 05/0 درصد با 3 تکرار در محیط کشت پایه MS مایع و به مدت 48 ساعت اعمال شد. بعد از 48 ساعت نمونهها با آب مقطر استریل شسته شده و به محیط کشت مایع MS 4/1منتقل گردید و در همان شرایط محیطی آزمایش قبل )شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سانتی گراد در شرایط تاریکی و با دور 180 دور در دقیقه) نگهداری شدند. ریشههای گیاهان غیر تراریخت هم به منظور مقایسه در آزمایشات آنالیز بیوشیمیایی و مولکولی با کشت بذر گیاه در محیط کشت پایه MS تهیه گردید.
عصارهگیری متانولی جهت اندازه گیری آنتی اکسیدان، فنول کل و فلاونوئید: مقدار 1/0 گرم از ریشههای خشک شده در آون، در هاون آسیاب شده و به داخل لوله آزمایش منتقل گردید. در زیر هود مقدار 10 میلیلیتر دی اتیل اتر داخل لوله اضافه و به مدت 24 ساعت در یخچال )4 درجه سانتی گراد) نگهداری شد. بعد از چند بار تکان دادن لولهها، عصاره اتری حاصله را در زیر هود داخل بشر 10 سی سی منتقل گردید. دوباره مقدار 5 میلیلیتر از اتر را داخل لوله ریخته و بعد از گذشت 5 ساعت با تبخیر شدن اتر، به ماده جامد باقی مانده مقدار 5 میلیلیتر متانول 80 درصد اضافه و سپس دیواره ظرف را کاملاً تمیز کرده تا به محلول اضافه بشود و در نهایت عصاره حاصل شده از صافی عبور داده شده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد (14 و 35)
فعالیتآنتیاکسیدانی: جهت اندازگیری فعالیت آنتیاکسیدانی به 50 میکرولیتر از عصاره متانولی نمونهها، 950 میکرولیتر DPPH (mol/lit 5-10×6( اضافه و پس از 15 تا 30 دقیقه در طول موج 517 نانومتر اسپکتروفتومتر قرائت و در فرمول زیر جای گذاری شد. جهت تهیه شاهد (بلنگ) آنتیاکسیدان نیز به روش بالا عمل کرده، فقط به جای عصاره، 50 میکرولیتر متانول 80 درصد اضافه شد (9).
AC : میزان جذب بلنگ 14AC-ASACأ—10"> 0
AS : میزان جذب نمونه
اندازهگیری فنول کل: به منظور اندازهگیری فنول کل ابتدا به 30 میکرولیتر عصاره متانولی، 90 میکرولیتر آب و 600 میکرولیتر فولین 10 درصد اضافه کرده و پس از 5 الی 10 دقیقه، 480 میکرولیتر کربنات سدیم 10 درصد اضافه شده و در نهایت 5/1 الی 2 ساعت در جای تاریک نگهداری گردید تا رنگ نمونهها به بنفش تغییر کند و سپس با دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 765 نانومتر قرائت شد. در نهایت مقدار جذب (Y) را در معادله حاصل از کالیبراسیون جای گذاری کرده تا مقدار فنول کل (X) بر حسب (µg/g DW) به دست آید (33).
Y 0.0007X+0.0145
اندازهگیریفلاونوئیدکل: برای اندازهگیری فلاونوئید کل به 500 میکرولیتر از عصاره متانولی، 150 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد اضافه کرده و پس از 5 دقیقه، 300 میکرولیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد اضافه شده و پس از 5 دقیقه، 1 میلیلیتر سود 1 مولار اضافه و در نهایت حجم نهایی با آب مقطر به 5 میلیلیتر رسانده شد و سپس با دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 380 نانومتر قرائت شد. مقدار جذب (Y) را در معادله زیر جای گذاری کرده تا مقدار فلاونوئید کل (X) بر حسب ( mg Qu/g DW) به دست آید. از کوئرسیتین به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده شد (32).
Y 14=0"> .002X+0.011
تأیید آنالیز PCR برای ریشه مویین: به منظور تأیید حضور ژن rolB، ابتدا DNA ژنومی هریک از ریشههای مویین به روش CTAB استخراج گردید (19). واکنش زنجیرهای پلی مراز به منظور تأیید حضور ژن rol B آگروباکتریوم رایزوژنز در ریشه های مویین انجام گردید توالی آغازگرهای زیر بر اساس توالی ژن در بانکهای اطلاعاتی طراحی و به منظور تکثیر قطعات 780 bpژن rol B مورد استفاده قرار گرفتند:
F : 5´- TGGATCCCAAATTGCTATTCCACGA-3´
R:5´-TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3´
واسرشتسازی اولیه به مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی گراد سپس 39 سیکل دمایی شامل مرحله واسرشت سازی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 53 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه و 20 ثانیه، بسط در دمای 72 درجه به مدت 1 دقیقه و 30 ثانیه در نهایت سیکل دمایی 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه امجام گرفت. به منظور آماده سازی باکتری به عنوان کنترل مثبت در واکنش PCR، مقداری از کلنی باکتری سویه 15834 در آب مقطر استریل حل شد سپس از محلول حاصل 1 میکرولیتر به تیوپهای حاوی 5/12 میکرولیتر PCR master mix، 1 میکرولیتر از هر آغازگر و 5/9 میکرولیتر آب مقطر استریل دیونیزه اضافه گردید. بعد از انجام واکنشPCR ، 5 میکرولیتر از محصول PCR به همراه 3 میکرولیتر Dye در ژل آگارز 1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید با ولتاژ 80 ولت، به مدت 1 ساعت و 45 دقیقه الکتروفورز گردید. به منظور مشخص شدن اندازه قطعات حاصل از DNA مارکر شرکت فرمنتاز استفاده گردید.
اندازه گیری میزان رزمارینیک اسید در نمونههای ریشه مویین زرین گیاه: در این پژوهش از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا مدل 1100 اجیلنت، مجهز به پمپ گرادیان چهار حلالی، با دتکتور فوتودیوداری، ستون C18، 30 سانتیمتری استفاده گردید. برای تهیه عصارهها از دستگاه اولتراسونیک یوروندا کشور ایتالیا و همچنین برای توزین ترازوی آزمایشگاهی آنالیتیکال به دقت 0001/0و 01/0 گرم مدل ED1245 شرکت سارتوریوس استفاده شد. برای کمی سازی رزمارینیک اسید در نمونهها، ابتدا محلول مادر 500 میلیگرم در لیتر از رزمارینیک اسید در حلال استونیتریل تهیه شد. پنج غلظت متفاوت 1، 6، 30، 60، 120 و 240 میلیگرم بر لیتر از رقیق سازی محلول مادر تهیه شد و با تزریق مستقیم 20 میکرولیتر از آن به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا زمان بازداری و سطح زیر پیک آنها مشخص شد. منحنی کالیبراسیون با استفاده از دادههای به دست آمده رسم گردید و معادله کالیبراسیون به دست آمد. بعد از رسم منحنی کالیبراسیون، نمونههای ریشه در هاون پودر و یکنواخت شد. برای تهیه عصاره از نمونهها، حدود 1/0 گرم از ریشه توزین و به لوله آزمایش منتقل گردید. 2 میلیلیتر از آبی که 1 درصد اسید استیک دارد به آن افزوده و پس از همزنی کامل به دستگاه اولتراسونیک منتقل گردید تا تحت امواج مافوق صوت قرار گیرد و تماس حلال استخراج کننده با نمونه کامل گردد. سپس نمونه سانتریفیوژ شده و از فاز بالایی و شفاف بعد از گذراندن از فیلتر به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا تزریق گردید. سطح زیر پیک کروماتوگرامهای نمونههای ریشه محاسبه شده و در معادله کالیبراسیون قرار گرفت و غلظت رزمارینیک اسید در نمونههای ریشه بر حسب (µg /mg DW) محاسبه گردید.
آنالیزآماری: تمام آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گردید. دادههای حاصل از آزمایشات در نرم افزار SAS 9.1 مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار گرفتند. مقایسات میانگین دادهها بر اساس آزمون چند دامنهای دانکن انجام گرفت و نمودارها با استفاده از نرم افزارExcel 2007 رسم گردید.
نتایجو بحث
تأثیر کلشیسین بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کلشیسین بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). بیشترین افزایش در میزان آنتی اکسیدان مربوط به سطح 05/0 درصد می باشد (33/90 درصد). این مقدار 23/1 برابر میزان آنتی اکسیدان در ریشههای مویین تیمار نشده و 43/1 برابر ریشههای غیرتراریخت می باشد. کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشههای غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید (شکل1 الف).
جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر کلشیسین بر فعالیت آنتی اکسیدانی، فنول کل و فلاونوئید کل در ریشههای مویین زرین گیاه
میانگین مربعات |
درجه |
منابع تغییرات |
||
فلاونوئید کل |
فنول کل |
فعالیت آنتیاکسیدانی |
|
|
**975/4279 |
**702/1034635 |
**766/339 |
4 |
کلشی سین |
183/15 |
247/49282 |
066/20 |
10 |
اشتباه آزمایش |
25/4 |
13/6 |
70/5 |
|
ضریب تغییرات (درصد) |
** نشان دهنده معنی دار در سطح احتمال 1 درصد، می باشد. |
شکل 1- نمودار اثرات کلشیسین بر الف: فعالیت آنتی اکسیدانی کل، ب: فنول کل، ج: فلاونوئید کل ریشههای مویین زرین گیاه. حروف مشابه نشان دهنده عدم اختلاف در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن می باشد. |
الف |
ج |
ب |
تأثیرکلشیسین بر میزان فنول کل: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کلشیسین بر میزان فنول کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). افزایش سطح کلشیسین تا 05/0 درصد با افزایش تولید فنول کل (µg/g DW61/1632) همراه بود. این مقدار 45/1 برابر میزان فنول کل در ریشههای مویین تیمار نشده و 29/11 برابر ریشههای غیرتراریخت بود. کمترین میزان فنول کل نیز در ریشههای غیر تراریخت (µg/g DW52/144) مشاهده گردید (شکل1 ب).
تأثیر کلشیسین بر میزان فلاونوئید کل: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کلشیسین بر میزان فلاونوئید کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 1). افزایش کلشیسین تا سطح 05/0 درصد با افزایش تولید فلاونوئید کل همراه بود (mg/g DW50/143). این مقدار 41/2 برابر میزان فلاونوئید کل در ریشههای مویین تیمار نشده و 66/2 برابر ریشههای غیرتراریخت می باشد. کمترین میزان فلاونوئید کل نیز در ریشههای غیر تراریخت (µg/g DW83/53) مشاهده گردید (شکل1 ج).
نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش غلظت کلشیسین در محیط کشت تجمع هر فاکتور ماده آنتی اکسیدان، فلاونوئید کل و فنول کل افزایش یافت ولی در این تحقیق بررسی در زمینه تغییر سطح پلوئیدی ریشهها انجام نگردید. افزایش رشد ریشههای مویین در اثر تیمار با کلشیسین می تواند به این دلیل باشد که کلشیسین منجر به افزایش سطح پلوئیدی شده و در نتیجه مضاعف شدگی مستقیم ژنومیک به وجود میآیند، مواد ژنتیکی آنها مشابه باقی مانده و فقط دز ژنی افزایش می آید، بنابراین منجر به افزایش تولید متابولیتها در اتوتتراپلوئیدها میشود. یک مدل رایج جهت توجیه این تغییرات را، کاهش نسبت غشای هسته به مقدار کروماتین آن میدانند. این کاهش سطح منجر به افزایش تماس ماده کروماتینی با غشای هستهای و در نتیجه افزایش فعالیت ژنی و بهبود روابط آبی، وضعیت هورمونی و سرعت فتوسنتز به ازای هر سلول را به دنبال دارد (25). از آنجا که فرض بر آن است که با دو برابر شدن ژنوم فعالیت متابولیکی، سنتز rRNA و نسخه برداری افزایش یابد، این افزایش می تواند بر میزان تنفس (8)، فعالیت ژنی و میزان فعالیت آنزیمها تأثیر داشته باشد (27). شواهد به دست آمده از آنالیزهای شیمیایی آلوپلیپلوئید نشان میدهد که چنین پلیپلوئیدهایی از لحاظ ترکیبات فنولی غنیتر بوده و نسبت به والدین خود تنوع آنزیمی بیشتری نشان میدهند (12). یافتههای این تحقیق با نتایج تحقیقات Dejessus- Gonzalezو Weathrs (11) در درمنه (Artemisia annua) و Lavania (23) در گیاه عطری ویتور (Vetiveria zizanioides L.) (24) مطابقت دارد.
تأثیر کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 2). با افزایش غلظت کیتوزان تا سطح mg/l100 فعالیت آنتی اکسیدانی افزایش نشان داد (66/89 درصد). این مقدار 22/1 برابر میزان فعالیت آنتی اکسیدانی در ریشههای مویین تیمار نشده و 42/1 برابر ریشههای غیرتراریخت بود. کمترین میزان فعالیت آنتی اکسیدانی نیز در ریشههای غیر تراریخت (63 درصد) مشاهده گردید (شکل 2 الف).
تأثیر کیتوزان بر میزان فنول کل: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فنول کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) وجود دارد (جدول 2). نتایج نشان داد که افزایش سطح کیتوزان تاmg/l 100 باعث افزایش در میزان فنول کل شد. بیشترین افزایش در میزان فنول کل مربوط به سطحmg/l 100 با میانگین µg/g WD 85/1617 و کمترین میزان فنول کل در ریشههای غیر تراریخت با میانگین µg/g DW52/144 بود. همچنین با افزایش غلظت کیتوزان به mg/l150 میزان فنول کل تولید شده نسبت به مقدار آن در ریشههای تیمار شده باmg/l 50 تفاوت معنیداری وجود نداشت (شکل 2 ب ).
جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر کیتوزان بر وزن تر و خشک، فعالیت آنتی اکسیدانی، فنول کل و فلاونوئید کل در ریشههای مویین زرین گیاه
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
|||||
فلاونوئید کل |
فنل کل |
فعالیت آنتیاکسیدانی |
وزن خشک |
وزن تر |
مواد مؤثره |
وزن تر و خشک |
|
**141/907 |
**817/1002488 |
**833/288 |
00009/0 ns |
**449/0 |
4 |
3 |
کیتوزان |
616/40 |
976/3019 |
600/7 |
00003/0 |
016/0 |
10 |
8 |
اشتباه ازمایش |
67/8 |
86/4 |
61/3 |
39/6 |
10/10 |
|
|
ضریب تغییرات (درصد) |
** و ns به ترتیب نشان دهنده معنی دار در سطح احتمال 1 درصد و عدم وجود اختلاف معنی دار می باشد. |
شکل 2- نمودار اثرات کیتوسان بر الف: فعالیت آنتی اکسیدانی کل، ب: فنول کل، ج: فلاونوئید کل ریشههای مویین زرین گیاه. حروف مشابه نشان دهنده عدم اختلاف در سطح احتمال 5 درصد آزمون دانکن می باشد.
|
الف |
ب |
ج |
تأثیر کیتوزان بر میزان فلاونوئید کل: آنالیز واریانس دادههای حاصل از اثر کیتوزان بر میزان فلاونوئید کل نشان داد که بین تیمارها اختلاف معنیدار در سطح (01/0 P<) قابل مشاهده می باشد (جدول 2). افزایش سطح کیتوزان تا سطح mg/l 100 باعث افزایش در میزان فلاونوئید کل شد. بیشترین افزایش در میزان فلاونوئید کل مربوط به سطحmg/l 100 با میانگین (µg/g DW33/96) و کمترین میزان فلاونوئید کل در ریشههای غیر تراریخت با (µg /g DW83/53) مشاهده گردید. با افزایش غلظت کیتوزان بهmg/l 150 میزان فلاونوئید کل تولید شده نسبت به مقدار آن در ریشههای تیمار شده باmg/l 50 تفاوت معنیداری نشان نداد ( شکل 2 ج).
نتایج مطالعه نشان داد که با تغییر غلظت کیتوزان، خصوصیات بیوشیمیایی ریشههای مویین تحت تیمار تحریکزایی تغییر مییابد اما این تغییر رابطه مستقیمی با افزایش غلظت عنصر محرک ندارد و می تواند در یک غلظت بهینه، حداکثر تغییرات بیوشیمیایی مشاهده و در بعد از آن یا کاهش در خصوصیات بیوشیمیایی و ترکیبات تولیدی اتفاق بیفتد و یا اینکه تغییر معنیداری بین غلظتهای بالای مورد استفاده و غلظت بهینه وجود نداشته باشد. نتایج سایر مطالعات نیز نشان داده است که غلظت محرک نقش مهمی در فرآیند تحریک دارد و عامل مؤثری بر شدت پاسخ است. غلظت مؤثر محرک بر حسب گونه گیاهی متفاوت است، به طوری که غلظتی از محرک که در یک گیاه اثر تحریکی بر متابولیتهای ثانویه دارد، ممکن است در گیاه دیگر اثری نداشته باشد. در غلظتهای بالا، محرکها واکنش فوق حساسیت را القاء میکنند که منجر به مرگ سلولها میگردد در حالی که غلظتهای پایین سبب القای واکنشهای دفاعی میگردد (21). مکانیسم اثر محرکهای زیستی در گیاهان به خوبی مشخص نشده است ولی به نظر می رسد که محرکهای زیستی (کیتوزان) به ترکیبات دیواره سلولی حمله میکنند و در پی پاسخ به پیام محرک، سیستم دفاعی گیاه فعال میشود. محرکها به وسیله گیرنده گیاهی یا R پروتئین شناسایی میشوند. شناسایی در دیواره پلاسما، آغاز سیگنال پاسخدهی می باشد. بعد از سیگنال تحریک، گیرندههای گیاهی سیگنال اجراییشان را مثل نشت یونی، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، فسفریلاسیون و دفسفریلاسیون پروتئینها را به کار میاندازد و به وسیله مولکولهای پیامبر دوم مثل H2O2، اسید جاسمونیک، اسید سالسلیک، آزادکنندههای کلسیم داخلی و تلفیق چند ژن و سرانجام بیان ژن دفاعی مانند فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) باعث تولید فیتوآلکسینهایی مانند فنولها میشوند. با این حال این وقایع و بر همکنش بین آنها پیچیده و هنوز در حال بررسی است (36). یافتههای این تحقیق با نتایج بیضایی و همکاران در تربچه (Raphanus sativus L.) (1) مطابقت دارد.
ریزنمونههای گیاهی تلقیح شده با سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز بعد از یک هفته ریشه مویین تولید کردند (شکل 3). نتایج آنالیزPCR برای ریشههای تراریختی احتمالی، حضور قطعهایی حدوداً به طول bp 780 مربوط به ژنrol B برای ریشههای حاصل از تلقیح با باکتری A.rhizogenes را نشان داد که هم اندازه قطعات تکثیر شده در نمونه کنترل مثبت (باکتری A. rhizogenes) بود، در صورتی که در ریشههای شاهد (ریشههای غیر تراریخت) به علت عدم تلقیح با A. rhizogenes هیچ نواری مشاهده نگردید (شکل 4).
میزان رزمارینیک اسید: مقدار رزمارینیک اسید در ریشههای غیرتراریخت، و ریشههای مویین تحت تأثیر محرکهای مختلف به وسیله دستگاه HPLC اندازگیری شد (شکل 5). مطابق (جدول 3) مقدار رزمارینیک اسید، کمترین مقدار رزمارینیک اسید مربوط به ریشههای غیر تراریخت، µg /mg DW 8/13 و بیشترین مقدار رزمارینیک اسید در ریشههای تراریخت تیمار شده با محرک کلشیسین با غلظت 05/0 درصد به میزان µg /mg DW 8/35 و کیتوزان با غلظت mg/l 100، به میزان µg /mg DW 1/15 می باشد. در تحقیق حاضر تجمع رزمارینیک اسید در ریشههای مویین احتمالاً به دلیل برخی تغییرات بیوشیمیایی در متابولیسم گیاه-آگروباکتریوم رایزوژنز می باشد (16). مقدار رزمارینیک اسید در ریشههایی که با محرکها تیمار شدهاند خیلی بیشتر از ریشههای تیمار نشده بود. بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در ریشههای مویین به صورت ژنتیکی کنترل میشود، اما مواد غذایی و شرایط محیطی نیز بر آن مؤثر می باشد (30).
جدول 3- اندازه گیری اسید رزمارینیک در تیمارهای مختلف زرین گیاه
نمونه |
غلظت اسید رزمارینیک (میکروگرم بر گرم وزن خشک) |
ریشههای غیر تراریخت |
8/13 |
ریشههای تراریخت تحت تیمار کلشیسین |
8/35 |
ریشههای تراریخت تحت تیمار کیتوزان |
1/15 |
در این مطالعه دو نوع محرک زیستی جهت تحریک تولید رزمارنیک اسید مورد استفاده قرار گرفت که نتایج آنالیز HPLC تغییر در میزان اسید رزمارینیک را در هر دو تیمار نشان داد. در ارتباط با دلیل اصلی اثر این محرکها بر تغییر تولید متابولیتهای ثانویه مطالعه جامعی انجام نشده است اما احتمال می رود که کلشیسین با جلوگیری از به هم پیوستن زیر واحدهای میکروتوبول )پروتئین توبولین( و یا با از هم باز نمودن آنها مانع از تشیکیل دوک در هنگام تقسیم سلولی شده، کروموزومها را در مرحلۀ متافاز متوقف میکند و مانع وقوع آنافاز در آنها می گردد. بنابراین، تقسیم سلولی بدون تشکیل دیوارة سلولی رخ میدهد که منجر به دو برابر شدن شمار کروموزومها در سلول گیاهی میگردد (18 و 34).
Yan و همکاران (38) تجمع رزمارینیک اسید و فعالیت آنزیمهای تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) و فنیل آلانین آمونیالیاز ((PAL را در Salvia miltiorrhiza تحت تیمار عصاره مخمر و + Agبررسی کردند. نتایج نشان داد که هر دو محرک منجر به تجمع رزمارینیک اسید گردید.
الف |
د |
ج |
ب |
شکل 3– القای ریشه مویین در ریزنمونه های مختلف گیاه زرین گیاه الف) ریزنمونههای برگ و میانگره یک هفتهای زرین گیاه کشت شده در محیط MS جامد. ب) ظهور ریشههای مویین روی ریزنمونههای برگ یک هفتهای ج) ریشه مویین (لاین پررشد) در محیط کشت جامد MS د) ریشه مویین (لاین کم رشد) در محیط MS جامد |
M C+ C1- C2- 1 2 3 4 |
1000 bp |
100 bp |
500 bp |
شکل 4- آنالیز واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تأیید حضور ژنrol B در ریشههای تراریخت زرین گیاه. .M : DNA مارکر 1kb (Fermentase). C+: باکتری آگروباگتریوم سویه 15834 به عنوان کنترل مثبت.-1C: واکنش PCR بدون DNA به عنوان کنترل منفی اول. -2C: ریشههای شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی دوم. لاین 1-4: ریشههای مویین القاء شده در ریزنمونههای برگ یک هفتهای توسط سویه 15834 آگروباکتریوم رایزوژنز. |
|
الف |
ج |
ب |
شکل 5- کروماتوگرام HPLC برای تعیین مقدار رزمارینیک اسید ریشه های مویین گیاه بذرالبنج مشبک
الف) نمونه استاندارد. ب) ریشههای تیمار شده با کلشیسین (05/0 درصد). ج) ریشههای تیمار شده با کیتوسان (mg/l100).
به کارگیری محرکها یکی از موفقترین استراتژیها در افزایش متابولیتهای ثانویه از جمله رزمارینیک اسید هستند. محرکها به عنوان محرکهای دفاعی و القاء کننده تنش در گیاه تعریف میشوند که به صورت مستقیم و غیرمستقیم با فعال کردن ژنهای مرتبط با بیوسنتز ترکیبات ثانویه سبب افزایش تولید این ترکیبات میگردند و میزان اثر محرکها بر تولید متابولیتهای ثانویه معمولاً به غلظت و زمان وابسته است (36). کیتوزان باعث تولید فیتوآلکسینها (29) و بسیاری از ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی(21) میشود. سنتز ترکیبات دفاعی گیاه پس از تحریک با کیتوزان، معمولاً مرتبط با فعالیتهای فیزیولوژیکی، عمدتاً بهعنوان آنتیاکسیدانها بهعنوان مثال پلیفنولها است (15). همچنین کیتوزان جهت افزایش عملکرد بسیاری از ترکیبات مفید در کشتهای آزمایشگاهی در بافتها و گیاهان کامل مورد استفاده قرار گرفته است. به عنوان مثال، در ریحان کیتوزان موجب افزایش مقدار کل ترکیبات فنولی و ترپندار، بهویژه اسید رزمارینیک و اوژنول شد (22).
نتیجهگیری
زرین گیاه از گیاهان دارویی مهم و باارزش می باشد که
به دلیل عدم توجه کافی دارای مشکلات متعددی می باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که امکان القاء و تولید ریشه مویین به راحتی با استفاده از انتخاب سویه و ریزنمونه مناسب فراهم بوده و استفاده از محرکهای مختلف می توان باعث ایجاد تغییر در تولید متابولیتهای ثانویه به ویژه رزمارینیک اسید شود. با تغییر نوع محرک و غلظت آن امکان تغییر متابولیتهای ثانویه و آنزیمهای آنتی اکسیدانی وجود دارد. به نظر می رسد با انتخاب و تعیین محرک مناسب زیستی یا غیر زیستی به راحتی امکان تولید متابولیتهای با ارزش از طریق کشت ریشه مویین فراهم گردد.